Vários métodos de estimativa de posição central com base em imagem (denominado "ajuste de centróide"), como métodos de ajuste Gaussiano 2-D, têm sido comumente usados ​​em microscopia de localização de molécula única (SMLM) para determinar com precisão a localização de cada fluoróforo. No entanto, ainda é um desafio melhorar a precisão de localização lateral de uma única molécula para a escala molecular ( <2 nm) para imagens de nanoestruturas de alto rendimento.

Em um estudo publicado online em Métodos da Natureza , O Prof. Xu Tao e o Prof. Ji Wei do Instituto de Biofísica da Academia Chinesa de Ciências desenvolveram um novo processo de microscopia de localização de molécula única interferométrica com iluminação estruturada de modulação rápida, chamada de exposição óptica seletiva repetitiva (ROSE).

ROSE utiliza seis diferentes direções e franjas de interferência de fase para excitar as moléculas fluorescentes. A intensidade das moléculas fluorescentes está intimamente relacionada à fase das franjas de interferência. Uma molécula de fluorescência é localizada pelas intensidades de múltiplos padrões de excitação de uma franja de interferência, proporcionando uma melhoria de cerca de duas vezes na precisão de localização. Esta técnica elevou a resolução da microscopia de localização de molécula única (SMLM) para menos de 3 nm (precisão de localização de ~ 1 nm).

Os pesquisadores primeiro projetaram três grades de rede diferentes de estruturas de origami de DNA com 5, Espaçamento ponto a ponto de 10 e 20 nm para verificar o desempenho do ROSE. Tanto o ajuste convencional do centróide quanto o ROSE podem resolver a estrutura de 20 nm com o mesmo orçamento de fótons. ROSE também pode resolver claramente a distância de 10 nm, que não pôde ser resolvido pelo ajuste do centróide.

Os pesquisadores demonstraram que ROSE pode resolver uma estrutura de 5 nm com uma resolução de ~ 3 nm em um grande campo de visão de 25 x 25 μm ² , o que significa que ROSE tem a capacidade de empurrar o poder de resolução do SMLM para a escala molecular.

Além disso, usando ROSE para analisar nanoestruturas celulares, os pesquisadores mostraram que ROSE tem vantagens em resolver a estrutura oca de filamentos de microtúbulos únicos, pequenas cavidades revestidas de clatrina (CCPs) e nanoestruturas celulares de filamento de actina. A análise de correlação de anel de Fourier (FRC) indicou que ROSE melhorou a resolução final em duas vezes em comparação com o método de ajuste do centróide.

ROSE pode ser estendida para imagens em escala nanométrica 3-D, introduzindo padrões de excitação adicionais ao longo da direção axial. Os pesquisadores imaginam que este método poderia estender a aplicação do SMLM na análise dinâmica de biomacromoléculas e estudos estruturais em escala molecular.