As proteínas são os cavalos de batalha da célula. Sua atividade é frequentemente controlada pela adição ou remoção de produtos químicos chamados fosfatos, como ligar ou desligar uma corrente elétrica. Medir quantas proteínas são fosforiladas, ou ligado, tem sido um obstáculo para a pesquisa. Como as proteínas fosforiladas são difíceis de obter em grandes quantidades, podem ser difíceis de analisar, mesmo usando instrumentos avançados, como um espectrômetro de massa.

Os pesquisadores do Pacific Northwest National Laboratory desenvolveram uma maneira de medir e distinguir pequenas quantidades de proteínas fosforiladas, uma abordagem que poderia ser usada em pesquisas para ajudar a tratar doenças como diabetes e câncer. O estudo aparece como artigo de capa da revista em 7 de maio Química Analítica .

Distinguir proteínas fosforiladas

Em um espectrômetro de massa, moléculas são coletadas em uma armadilha logo à frente do dispositivo de medição - como veículos esperando em uma rampa de acesso à rodovia com taxímetro, disse a co-autora Karin D. Rodland, um colega de laboratório PNNL e pesquisador biomédico. A armadilha é liberada assim que acumula moléculas suficientes. Isso permite que as moléculas avancem como os veículos quando a luz da rampa de acesso fica verde.

Mas quando baixos níveis de proteínas fosforiladas estão em uma amostra, seu sinal é frequentemente muito fraco para um espectrômetro de massa detectar, então as moléculas ficam presas antes mesmo de serem medidas.

Neste estudo, os pesquisadores procuraram amplificar os sinais para contornar a barreira e fazer até mesmo os baixos níveis de proteínas mensuráveis. Para ser capaz de fazer isso, a equipe implantou uma técnica existente chamada rotulagem isobárica, que marca quimicamente as amostras. Cada etiqueta é única, fixa e identifica todas as proteínas de uma determinada amostra. Mais importante, uma vez que as amostras marcadas individualmente são misturadas, eles se tornam um único, amostra quimicamente idêntica.

"Aos olhos do especulador de massa, "disse o autor correspondente Tao Liu, um cientista biomédico do PNNL, "a amostra aparece como uma identidade."

Inteligentemente, os pesquisadores marcaram isobáricamente e misturaram um material de "reforço" com as amostras do estudo que eram limitadas em quantidade, a uma proporção de reforço / amostra de 30 para 1. Este material de reforço é biologicamente semelhante às amostras do estudo, de modo que os catálogos de proteínas são semelhantes e estão prontamente disponíveis em uma quantidade muito maior. Por exemplo, linhas celulares mistas podem ser usadas para imitar os tecidos.

Combinar o material de reforço e as amostras de estudo tornou o sinal geral grande o suficiente para ser detectado pela especificação de massa. Isso basicamente enganou o instrumento - que é incapaz de fazer quaisquer medições quando a amostra é muito pequena - iluminando com luz verde toda a amostra para análise.

A tecnologia é muito parecida com carros e caminhões se classificando por velocidade assim que entram na rodovia, e, em seguida, escolhendo os carros por suas cores, disse Rodland. Esses veículos nunca teriam sido classificados se não tivessem recebido o sinal "vá" do dispositivo de medição.

À medida que o espectro de massa se separou, a amostra marcada isobaricamente e misturada para análise, as proporções em que as marcas apareceram permitiram aos cientistas determinar quanto de cada peptídeo estava em cada amostra original.

Avanços na detecção de doenças

Usando a estratégia de rotulagem / reforço isobárica, a equipe demonstrou pela primeira vez que três linhas celulares diferentes de leucemia mieloide aguda - um tipo de câncer que começa na medula óssea - podem ser efetivamente distinguidas com base em seus perfis de atividade proteica, usando um número relativamente pequeno de células.

Os pesquisadores então voltaram sua atenção para as ilhotas pancreáticas, que desempenham um papel central na diabetes. Esses aglomerados de células produzem hormônios - insulina e glucagon - que trabalham juntos para evitar que os níveis de glicose no sangue fiquem muito altos ou muito baixos. As células são alvos em pacientes com Tipo 1, ou dependente de insulina, diabetes. Contudo, a atividade da proteína em ilhotas humanas é difícil de estudar devido ao seu conteúdo limitado de proteína. Usando a nova técnica, os pesquisadores analisaram as mudanças na atividade das proteínas em ilhotas humanas em resposta ao tratamento - uma aspiração há muito procurada pelos médicos que monitoram seus pacientes.

"Isso nos dará uma nova visão sobre o que acontece quando as células produtoras de insulina morrem em pacientes com diabetes, "disse Wei-Jun Qian, o outro autor correspondente do artigo e um cientista biomédico do PNNL. "A capacidade de rastrear a atividade da proteína com mais rigor nos ajudará a entender quais vias de sinalização estão envolvidas na morte celular."

No horizonte

A nova abordagem é promissora para vários tipos de pesquisa biológica e biomédica quando o material de amostra é escasso. Os usos podem incluir a comparação de células antes e depois do tratamento com drogas, testando diferentes doses, ou estudar o momento da ativação ou desativação da proteína.

"As possibilidades são infinitas, "disse Liu." Você pode fazer uma quantificação em grande escala, e também você pode combinar muitas condições diferentes que deseja estudar em um experimento. "