Um dos principais desafios da proteômica, o estudo de todas as proteínas expressas por uma célula ou organismo, é a distinção entre moléculas que são estruturalmente diferentes, mas têm a mesma massa. Isso é difícil porque um espectrômetro de massa, o principal aparelho utilizado neste tipo de estudo, funciona como uma balança, classificando as moléculas analisadas de acordo com sua massa.

Uma maneira de reduzir a confusão ao usar um espectrômetro de massa é começar submetendo a amostra à cromatografia líquida, que separa as proteínas hidrofílicas ("amantes da água") das hidrofóbicas. As proteínas hidrofílicas entram no espectrômetro primeiro, e os mais hidrofóbicos ficam para o fim, diminuindo a probabilidade de que duas moléculas diferentes com massas equivalentes sejam interpretadas como apenas uma pelo aparelho.

"É como resolver um quebra-cabeça com milhões de peças. Quando você abre a bolsa pela primeira vez, as peças estão todas misturadas e sobrepostas. Você deve começar classificando-os. Enquanto trabalhamos com proteômica, constantemente nos esforçamos para desenvolver técnicas de classificação mais refinadas, "disse Daniel Martins-de-Souza, que chefia o Laboratório de Neuroproteômica da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) no Brasil.

Em um estudo com resultados publicados recentemente em Proteômica , O grupo de Martins-de-Souza otimizou um método para aumentar a resolução da análise proteômica por espectrometria de massa. Graças a uma combinação de duas outras técnicas - cromatografia líquida bidimensional e mobilidade iônica - o grupo conseguiu identificar 10, 390 proteínas expressas em oligodendrócitos, as células do sistema nervoso central responsáveis ​​pela produção de mielina, uma substância lipídica que desempenha um papel essencial na troca de informações entre os neurônios.

Com o apoio da FAPESP, o grupo UNICAMP estudou o proteoma de oligodendrócitos humanos por vários anos, com o objetivo de melhor compreender as causas da esquizofrenia como base para propor novas abordagens terapêuticas. "Agora temos um banco de dados de proteínas de oligodendrócitos muito mais completo, que será útil para os nossos próprios estudos e os de outros pesquisadores da área, "Martins-de-Souza disse." Está disponível online, e os dados podem ser baixados. Além disso, a técnica de otimização pode ser usada para estudar o proteoma de qualquer amostra biológica. "

Em um estudo anterior usando cromatografia líquida unidimensional para pré-classificação, o grupo identificou apenas 2, 290 proteínas em oligodendrócitos.

Segundo Martins-de-Souza, os tratamentos atualmente disponíveis para a esquizofrenia se concentram nos neurônios, mas as falhas de comunicação neural observadas em pacientes podem ser devidas à disfunção de oligodendrócitos. "Uma de nossas linhas de pesquisa consiste em avaliar como os medicamentos usados ​​para controlar a esquizofrenia modificam o proteoma de oligodendrócitos, "disse ele." Com esta nova metodologia, podemos obter cinco vezes mais informações sobre o papel dessas drogas. "

O estudo foi realizado durante a pesquisa de pós-doutorado de Juliana Silva Cassoli e a pesquisa de mestrado de Caroline Brandão Teles, ambos com bolsa da FAPESP e orientação de Martins-de-Souza. O primeiro passo na análise proteômica usando espectrometria de massa é quebrar as proteínas extraídas da amostra biológica de interesse, que neste caso consiste em oligodendrócitos, em partículas menores chamadas de peptídeos.

"Uma pequena proteína pode dar origem a pelo menos 10 peptídeos diferentes. O espectrômetro não é bom para analisar a molécula inteira por causa de seu tamanho grande, "Martins-de-Souza explicou.

Próximo, o grupo submeteu a amostra à separação por cromatografia. Em vez de usar uma única matriz, como na técnica convencional, eles usaram dois. Na primeira separação, apenas um quinto dos peptídeos injetados entrou no espectrômetro na forma líquida. Este foi seguido por outro quinto na segunda separação, e assim por diante.

"É como se você espalhasse as peças do quebra-cabeça com as duas mãos em vez de apenas uma, "Disse Martins-de-Souza.

Dentro do espectrômetro, a amostra é transformada em gás e voa para a frente e para trás no vácuo. Quanto menor o peptídeo, quanto mais rápido chega ao seu destino, e o aparelho então mede sua massa.

Enquanto as moléculas estão voando dentro do espectrômetro, a técnica de mobilidade iônica injeta uma pequena quantidade de gás no aparelho por meio de um tubo.

“A resistência oferecida ao gás pela molécula depende de sua forma tridimensional, então, se dois peptídeos diferentes com a mesma massa estiverem voando juntos e nós injetarmos o gás na direção oposta, eles tendem a ser separados pela força de resistência ao gás. É como pegar duas folhas de papel com a mesma massa, amassando um em uma bola, e abandonando os dois. Por causa de sua forma, a folha amassada chegará ao chão primeiro, "Martins-de-Souza explicou.

No final do experimento, mais de 223, 000 peptídeos identificados pelo espectrômetro foram reconstruídos usando ferramentas de bioinformática, resultando em 10, 390 proteínas descritas no artigo. O grupo também usou a bioinformática para mapear os compartimentos celulares em que as proteínas estão localizadas e os processos biológicos nos quais estão envolvidas.

"Idealmente, it should be possible to identify at least two peptides per protein. That way, we can be sure a molecule is really present in the sample, since two proteins with two exactly identical peptides are unlikely to occur. Neste estudo, about 20% of the proteins were identified by more than 20 peptides, " Martins-de-Souza said.

The methodology enabled the researchers to identify even proteins that were relatively scarce in the sample, ou seja, in quantities some 10 million times smaller than those of the most highly expressed molecules.

"One of the problems with mass spectrometry is that a very large piece of the jigsaw puzzle may hide several smaller ones. However, with an effective tool to spread out the pieces, you can see practically all of them, " Martins-de-Souza said.