Com uma nova técnica para criar um espectro de corantes brilhantes, os químicos não estão mais perseguindo o arco-íris.

Trocar blocos de construção químicos específicos em moléculas fluorescentes chamadas rodaminas pode gerar quase todas as cores que os cientistas desejam - ROYGBIV e além, pesquisadores relatam 4 de setembro, 2017 no jornal Métodos da Natureza .

O trabalho oferece aos cientistas uma maneira de ajustar deliberadamente as propriedades dos corantes existentes, tornando-os mais ousados, mais brilhante, e também mais permeável às células. Essa paleta expandida de corantes poderia ajudar os pesquisadores a iluminar melhor o funcionamento interno das células, diz o líder do estudo, Luke Lavis, um líder de grupo no Campus de Pesquisa Janelia do Howard Hughes Medical Institute em Ashburn, Virgínia. Sua equipe iluminou núcleos celulares, fez os cérebros das larvas de mosca-das-frutas brilharem, e destacou neurônios do córtex visual em camundongos que tinham minúsculas janelas de vidro encaixadas em seus crânios.

Os cientistas costumavam inventar diferentes corantes, principalmente por tentativa e erro, Lavis diz. "Agora, descobrimos as regras, e podemos fazer quase qualquer cor. ”O método de sua equipe poderia permitir que os químicos sintetizassem centenas de cores diferentes.

Uma história brilhante

Até cerca de 20 anos atrás, os cientistas confiaram em corantes fluorescentes químicos para tornar visíveis as moléculas biológicas. Para espiar dentro das células, coloração de organelas, e outros experimentos de imagem, "a química era rei, "Lavis escreveu em 13 de julho, Perspectiva de 2017 no jornal Bioquímica . E então, o rei foi expulso do trono - por uma proteína de água-viva verde brilhante chamada GFP.

Em 1994, cientistas relataram o uso de um truque genético para combater a GFP, a proteína verde fluorescente, em outras proteínas celulares; é como forçar as proteínas a segurar um bastão luminoso. Esse truque deu aos pesquisadores uma maneira mais simples de rastrear os movimentos das proteínas em um microscópio - sem usar corantes sintéticos caros. A inovação atingiu o campo da imagem biológica. Em 2007, A mistura de GFP e duas outras proteínas fluorescentes pelos cientistas permitiu que eles pintassem os neurônios de camundongos em um desfile de cores vivas em uma técnica conhecida como "Brainbow". Um ano depois, a descoberta e o desenvolvimento do GFP renderam o Prêmio Nobel de Química para três cientistas, incluindo o falecido Roger Tsien, um investigador HHMI.

Mas o GFP também tem alguns lados sombrios. É uma molécula relativamente desajeitada construída a partir de um conjunto limitado de aminoácidos naturais. Portanto, o GFP nem sempre é brilhante o suficiente para revelar o que os cientistas estão tentando ver.

Então, os pesquisadores voltaram para a química. Os cientistas desenvolveram microscópios de ponta e novas técnicas para rotular o conteúdo celular, Lavis diz, mas os corantes para marcar as moléculas dentro das células ainda estavam presos no século XIX. Sua equipe se concentrou em rodaminas, porque eles são especialmente brilhantes e permeáveis ​​às células - então eles deslizam facilmente para dentro das células e as fazem brilhar. Mas apesar de trabalhar com rodaminas por mais de 100 anos, os químicos criaram apenas algumas dezenas de cores, e a maioria tinha tons semelhantes, variando de verde a laranja.

Até recentemente, fazer novas rodaminas não foi fácil. Os cientistas ainda usavam técnicas desde os primeiros dias da química, fervendo ingredientes químicos em ácido sulfúrico. Isso força as moléculas a se unirem no que é chamado de reação de condensação. A mistura de diferentes blocos de construção pode resultar em corantes novos e incomuns. Mas os ingredientes tinham que ser resistentes o suficiente para sobreviver ao banho de ácido fervente - o que não deixava muitas opções.

Faça brilhar

Em 2011, A equipe de Lavis desenvolveu uma nova maneira de mexer na estrutura das rodaminas, sob condições mais amenas. Usando uma reação desencadeada pelo paládio metálico, os pesquisadores podiam pular a etapa do ácido e construir corantes com blocos de construção mais complicados do que os usados ​​antes.

Este tipo, abordagem mais suave abriu a porta para um novo mundo de tinturas, e a equipe de Lavis mergulhou. Quatro anos depois, eles revelaram os corantes Janelia Fluor, moléculas fluorescentes até 50 vezes mais brilhantes do que outros corantes, e mais estável também. O segredo por trás dos corantes Janelia Fluor é um minúsculo apêndice em forma de quadrado chamado anel de azetidina - uma estrutura que só foi possível graças à nova abordagem química de Lavis.

Os cientistas podem usar uma variedade de estratégias para obter as moléculas do corante brilhante na proteína que desejam estudar. Então, eles podem se concentrar na proteína iluminada, e observe-o se mexer e interagir com outras moléculas - sem a confusão de fundo usual.

"Para nós, foi uma revolução total no campo da imagem de uma única molécula, "diz o biólogo molecular Xavier Darzacq, da Universidade da Califórnia, Berkeley. Antes de usar os corantes Janelia Fluor, as proteínas do fator de transcrição com marcação fluorescente que sua equipe estudou eram muito fracas para capturar em imagens nítidas. Os pesquisadores tiveram que manter o obturador da câmera aberto por 10 milissegundos para coletar luz suficiente. É tempo suficiente para as proteínas vagarem, então a imagem sairia borrada - como a fotografia de uma criança se contorcendo. Mas os corantes Janelia são brilhantes o suficiente para que sua equipe possa capturar moléculas em ação em apenas um milissegundo, Darzacq diz. Esses instantâneos rápidos permitiram que sua equipe fizesse experimentos de laboratório que ele descreve como "simplesmente impensáveis ​​alguns anos atrás".

Agora, O grupo de Lavis descobriu como fazer o ajuste fino de seus corantes fluorescentes, ajustando ainda mais a estrutura das rodaminas. As rodaminas têm um design básico de quatro anéis com grupos de átomos saindo de diferentes partes dos anéis. Em trabalhos anteriores, os cientistas desenvolveram estratégias para tinturas de afinação grosseira - corte um apêndice inteiro aqui, e você pode fazer um corante verde. Coloque um átomo de silício lá, e você tem vermelho. Lavis descobriu que, colocando cuidadosamente apenas alguns novos átomos na estrutura do corante, a cor e as propriedades químicas dos corantes também podem ser ajustadas, permitindo muitos tons de verde de um único andaime. É como ir do clássico pacote de oito lápis de cor para a caixa jumbo de 64.

Em um papel separado, publicado em 9 de agosto, 2017 no jornal ACS Central Science , a equipe descreveu uma maneira de modificar o anel inferior da estrutura do corante.

"O principal é que tudo é modular e racional, "Lavis diz. Selecione os átomos certos, ele explica, e os químicos podem projetar tintas com quase todas as propriedades que desejarem.

Seu grupo enxertou diferentes produtos químicos nas rodaminas, e então analisou as propriedades dos novos corantes. "Ninguém nunca tinha olhado para rodaminas dessa forma sistemática antes, "diz o co-autor Jonathan Grimm, um cientista sênior da Janelia.

Os corantes são sintetizados em uma única etapa com ingredientes baratos, Lavis diz. Isso torna os corantes mais baratos do que as alternativas comerciais - centavos por frasco. O baixo custo permitiu que sua equipe compartilhasse seu trabalho com cientistas de todo o mundo. Lavis, Grimm, e colegas já enviaram milhares de frascos para centenas de laboratórios diferentes.

"Essas tinturas são uma virada de jogo completa, "diz Ethan Garner, um biólogo de células bacterianas da Universidade de Harvard que os usou para rastrear o caminho de moléculas individuais em seu laboratório. A única desvantagem era que os cientistas não tinham muitas cores diferentes para escolher. Mas agora, ele diz, com o trabalho de Lavis, "Eles podem realmente cobrir toda a faixa espectral."