É possível clonar organismos inteiros, como Dolly, a ovelha, mas a clonagem de DNA é diferente. Ele usa técnicas de biologia molecular para fazer cópias idênticas de seqüências de DNA ou genes únicos.
Usando métodos de engenharia genética, segmentos do código genético do DNA são identificados e isolados. A clonagem de DNA copia as seqüências de ácidos nucléicos nos segmentos.
As cópias idênticas resultantes podem ser usadas para pesquisas posteriores ou para aplicações em biotecnologia. Muitas vezes, o gene copiado codifica uma proteína que pode fazer parte de tratamentos médicos. A tecnologia de DNA, incluindo a clonagem de DNA, está apoiando a compreensão de como os genes funcionam e como o código genético dos seres humanos influencia o funcionamento do corpo.
Clonagem de DNA: Visão Geral do Processo e Definição
A clonagem de DNA é o processo de biologia molecular de fazer cópias idênticas de segmentos de DNA localizados nos cromossomos que contêm o código genético de organismos avançados.
O processo gera grandes quantidades das sequências de DNA alvo . O objetivo da clonagem de DNA é produzir as próprias seqüências de DNA alvo ou produzir as proteínas codificadas nas seqüências alvo. Os dois métodos usados na clonagem de DNA são chamados vetor plasmídeo No método PCR, o segmento de fitas de DNA a serem duplicadas é marcado com enzimas chamadas primers O vetor do método refere-se ao plasmídeo usado para reter o segmento de DNA alvo. para ser clonado. Os plasmídeos são pequenas cadeias circulares de DNA não-cromossômico e encontradas em muitos organismos, incluindo bactérias e vírus. Selecionando e isolando o DNA alvo: Antes que o processo de clonagem de DNA possa começar, as sequências de DNA precisam ser identificadas, especialmente o início e o final dos segmentos de DNA. Essas sequências de DNA podem pode ser encontrado usando o DNA clonado existente com sequências conhecidas ou estudando a proteína produzida pela sequência de DNA alvo. Depois que a sequência é conhecida, as enzimas de restrição correspondentes podem ser usadas. Corte do DNA alvo com enzimas de restrição: As enzimas de restrição são selecionadas para procurar o código do DNA no início e no final das seqüências alvo. Quando as enzimas de restrição encontram uma sequência codificada especial de pares de bases denominadas locais de restrição, elas se ligam ao DNA naquele local e se enrolam em torno da molécula de DNA, rompendo a cadeia. Os segmentos de DNA de corte que contêm a sequência alvo estão agora disponíveis para duplicação. Escolhendo o vetor plasmídeo e inserindo o DNA alvo: Um plasmídeo adequado idealmente contém idealmente as mesmas seqüências de codificação de DNA da cadeia de DNA da qual o DNA alvo estava. cortar. A fita de DNA circular do plasmídeo é cortada com as mesmas enzimas de restrição usadas para cortar o DNA alvo. Uma enzima DNA ligase é usada para promover a ligação do segmento de DNA e as extremidades do segmento de DNA alvo está ligado às extremidades cortadas do DNA plasmídico. O DNA alvo agora faz parte da cadeia circular de DNA do plasmídeo. Inserindo o plasmídeo em uma célula bacteriana: Uma vez que o plasmídeo contenha a sequência de DNA a ser clonada, a clonagem real poderá ocorrer usando um processo chamado transformação bacteriana Colheita do DNA e proteínas clonados: A maioria dos plasmídeos usados para clonagem de DNA possui genes de resistência a antibióticos incorporados em seu DNA. À medida que as células bacterianas absorvem os novos plasmídeos, elas se tornam resistentes aos antibióticos. Quando a cultura é tratada com antibióticos, apenas as células que absorveram os novos plasmídeos sobrevivem. O resultado é uma cultura pura de células bacterianas com DNA clonado. Esse DNA pode ser colhido ou a proteína correspondente pode ser produzida. O método de PCR é mais simples e copia o DNA existente. Não requer corte com enzimas de restrição ou inserção de sequências de DNA plasmídico. Isso o torna especialmente adequado para clonar amostras de DNA com um número limitado de filamentos de DNA. Embora o método possa clonar o DNA, ele não pode ser usado para a produção da proteína correspondente. Desenrolando as cadeias de DNA: o DNA nos cromossomos é enrolado firmemente em uma estrutura de dupla hélice. Aquecer o DNA a 96 graus Celsius em um processo chamado desnaturação Selecionando os iniciadores: Como na clonagem de DNA do vetor plasmídeo, as seqüências de DNA a serem clonadas precisam ser identificadas com ênfase especial no começos e fins dos segmentos de DNA. Os primers são enzimas que se ligam a seqüências específicas de código de DNA e precisam ser selecionados para marcar os segmentos de DNA alvo. Os iniciadores certos se ligam às seqüências das moléculas de DNA para marcar o início e o fim dos segmentos-alvo. Recozendo a reação para ligar os primers: Resfriar a reação a cerca de 55 graus Celsius é chamado recozimento Produzindo cópias idênticas do segmento de DNA alvo: em um processo chamado extension Aumentando o rendimento do DNA clonado: O processo inicial de recozimento e extensão cria relativamente poucas cópias dos segmentos de cadeia de DNA disponíveis. Para aumentar o rendimento através da replicação adicional do DNA, a reação é resfriada novamente para reativar os primers e deixá-los se ligar a outras fitas de DNA. Em seguida, o reaquecimento da reação ativa a enzima polimerase novamente e mais cópias ", 1] ,Esse ciclo pode ser repetido 25 a 30 vezes. O método do vetor plasmídeo depende de um amplo suprimento inicial de DNA para cortar e inserir nos plasmídeos. Muito pouco DNA original resulta em menos plasmídeos e um início lento na produção de DNA clonado. O método de PCR pode produzir uma grande quantidade de DNA a partir de poucas cadeias de DNA originais, mas porque o DNA não é implantado em uma célula bacteriana , a produção de proteínas não é possível. Para produzir a proteína codificada nos fragmentos de DNA a serem clonados a partir de uma pequena amostra inicial de DNA, os dois métodos podem ser usados juntos e podem se complementar. Primeiro, o método de PCR é usado para clonar o DNA de uma amostra pequena e produzir muitas cópias. Em seguida, os produtos de PCR são usados com o método do vetor plasmídeo para implantar o DNA produzido nas células bacterianas que produzirão a proteína desejada. A biologia molecular utiliza a clonagem de genes e a replicação de DNA para fins médicos e comerciais. As bactérias com sequências de DNA clonadas são usadas para produzir medicamentos e substituir substâncias que as pessoas com distúrbios genéticos não podem produzir por si mesmas. Os usos típicos incluem: A biotecnologia também usa a clonagem de genes na agricultura para criar novas características em plantas e animais ou aprimorar as características existentes. À medida que mais genes são clonados, o número de usos possíveis aumenta exponencialmente. As moléculas de DNA compõem uma pequena fração do material em uma célula viva, e é difícil isolar as influências dos muitos genes. Os métodos de clonagem de DNA fornecem grandes quantidades de uma sequência de DNA específica para o estudo, e o DNA está produzindo proteínas da mesma forma que produziu na célula original. A clonagem de DNA torna possível o estudo desta operação para diferentes genes isolados. As aplicações típicas de pesquisa e tecnologia de DNA incluem o exame: Quando mais seqüências de DNA são clonadas, é mais fácil de encontrar e clonar seqüências adicionais. Os segmentos de DNA clonado existentes podem ser usados para determinar se um novo segmento corresponde ao antigo e quais partes são diferentes. Identificar uma sequência de DNA alvo é, então, mais rápido e preciso. Em terapia gênica A terapia gênica ainda é experimental e poucos pacientes foram curados usando a técnica. Os problemas estão na identificação do único gene responsável por uma condição médica e na entrega de muitas cópias do gene às células certas. À medida que a clonagem de DNA se tornou mais difundida, a terapia genética foi aplicada em várias situações específicas. Recentes aplicações bem-sucedidas incluem: A terapia gênica é uma das aplicações mais promissoras da clonagem de DNA, mas é provável que outros novos usos proliferem à medida que mais seqüências de DNA são estudadas e sua função é determinado. A clonagem de DNA fornece a matéria-prima para a engenharia genética nas quantidades necessárias. Quando o papel dos genes é conhecido e sua função adequada pode ser assegurada através da substituição de genes defeituosos, muitas doenças crônicas e até câncer podem ser atacadas e tratado em nível genético usando a tecnologia do DNA. Conteúdo relacionado:
e > reação em cadeia da polimerase (PCR)
. No método do vetor plasmídico, as cadeias de DNA são cortadas usando enzimas de restrição para produzir fragmentos de DNA e os segmentos resultantes são inseridos em vetores de clonagem chamados plasmídeos para posterior duplicação. Os plasmídeos são colocados em células bacterianas que produzem cópias de DNA ou proteínas codificadas.
. Uma enzima polimerase faz cópias da parte marcada da fita de DNA. Este método não utiliza enzimas de restrição e pode produzir DNA clonado a partir de pequenas amostras. Às vezes, os dois métodos de tecnologia de DNA são usados juntos para incorporar as melhores características de cada um em uma reação geral.
O método do vetor plasmídeo
plasmídeos bacterianos são o vetor usado para inserir o segmento de DNA alvo nas células bacterianas para posterior duplicação.
. Os plasmídeos são inseridos em uma célula bacteriana como E. coli, e as células com os novos segmentos de DNA começarão a produzir cópias e as proteínas correspondentes.
Na transformação bacteriana, as células hospedeiras e os plasmídeos são incubados juntos em temperatura corporal por cerca de 12 horas. As células absorvem alguns dos plasmídeos e os tratam como seu próprio DNA plasmídico.
O método de PCR (reação em cadeia da polimerase)
faz com que a molécula de DNA se desenrole e separe em duas vertentes. Essa separação é necessária porque apenas uma única cadeia de DNA pode ser clonada ao mesmo tempo.
À medida que a reação esfria, os iniciadores são ativados e se ligam à fita de DNA em cada extremidade de um segmento de DNA alvo. Os iniciadores agem apenas como marcadores e a fita de DNA não precisa ser cortada.
, o TAQ sensível ao calor enzima polimerase é adicionada à reação. A reação é então aquecida a 72 graus Celsius, ativando a enzima. A enzima DNA polimerase ativa se liga aos iniciadores e copia a sequência de DNA entre eles. O processo inicial de seqüenciamento e clonagem de DNA está completo.
Usando os métodos de clonagem de vetor plasmídeo e de PCR em conjunto
Exemplos de clonagem de DNA para biotecnologia
Exemplos de clonagem de DNA para pesquisas
Exemplos de clonagem de DNA para terapia gênica
, um gene clonado é apresentado às células de um organismo cuja "natural gene is damaged.", 3, [[Um gene vital que produz uma proteína necessária para uma função específica do organismo pode ser mutado, alterado pela radiação ou afetado por vírus. Quando o gene não funciona adequadamente, falta uma substância importante na célula. A terapia gênica tenta substituir o gene por uma versão clonada que produza a substância necessária.
