Quando se trata de medir o comprimento dos fragmentos de DNA, que são muito menores que as células, os microbiologistas precisam de um truque, e o mais conveniente é a eletroforese em gel. Esse método baseia-se no fato de fragmentos de DNA serem carregados e é uma alternativa a métodos mais caros, como a cristalografia de raios-X, responsável pela descoberta da estrutura de dupla hélice do DNA.
Como a eletroforese em gel Funciona
Como as moléculas de DNA são carregadas, elas são afetadas por uma corrente elétrica. Quando você os coloca em um gel neutro e coloca uma corrente no gel, as moléculas migram em direção ao eletrodo positivo (ânodo). Como moléculas de DNA de tamanhos diferentes carregam a mesma carga, as menores viajam mais rapidamente, portanto esse processo separa as moléculas em faixas que podem ser comparadas a amostras de tamanhos conhecidos.
Procedimento básico de eletroforese
O gel é geralmente feito de agarose, um polissacarídeo que quando aquecido em uma solução tampão forma um gel semi-sólido e levemente poroso. Em uma extremidade, o gel forma pequenos recuos chamados poços, onde o pesquisador coloca as amostras de DNA em estudo, juntamente com amostras de referência de comprimento conhecido, chamadas de escada de DNA. Os comprimentos dos fragmentos da escada foram pré-determinados por outro método, como a cristalografia por raios X.
Quando o gel é imerso em uma solução condutora e a voltagem é aplicada, os fragmentos começam a migrar pelo gel - os menores primeiro e os maiores e mais lentos atrás. Eles acabam se transformando em bandas espectrais, de acordo com o tamanho.
Quando isso ocorre, o pesquisador desliga a energia, infunde o gel com um corante de ligação a DVA e examina as amostras sob luz ultravioleta. Usando a escada como referência, o pesquisador pode determinar o tamanho de cada um dos fragmentos em uma faixa visível. Somente bandas são visíveis - fragmentos de DNA individuais são pequenos demais para serem vistos.
Determinando comprimentos de fragmentos desconhecidos
As chances não são de que todas as bandas de uma amostra se emparelhem com uma banda na escada, para determinar os tamanhos desses fragmentos desconhecidos, os cientistas geralmente traçam um gráfico. No eixo x está a distância percorrida por cada banda na escada em milímetros, enquanto no eixo y está o tamanho de cada banda. Quando os pontos são conectados por uma curva, o tamanho de qualquer banda pode ser extrapolado da curva após medir a distância percorrida por essa banda em milímetros.