A eletroforese em gel é uma técnica em que moléculas biológicas são separadas umas das outras e identificadas em pesquisas biológicas ou diagnósticos médicos. Desde o seu desenvolvimento na década de 1970, essas técnicas têm sido inestimáveis ​​na identificação de genes (DNA) e produtos genéticos (RNA e proteína) de interesse de pesquisa. Nos últimos anos, surgiram novas técnicas que dão maior especificidade e detalhes sobre o que está acontecendo nos sistemas vivos. Embora estas não tenham suplantado as técnicas de eletroforese, e manipulações avançadas possam expandir a viabilidade da técnica, é importante perceber o que a eletroforese em gel pode ou não fazer.

Eletroforese tem análise de amostra limitada -

Eletroforese é específico para qualquer tecido que você tenha amostrado. Por exemplo, se você executar um Southern Blot (um tipo de eletroforese) em um swab da bochecha, você está olhando genes das células epiteliais da sua bochecha e em nenhum outro lugar em seu corpo. Às vezes, isso pode ser benéfico, mas os pesquisadores estão freqüentemente interessados ​​em efeitos mais difundidos.

Técnicas como a hibridização in situ (ISH) podem captar uma seção do tecido e analisar a expressão gênica em cada pequena área da amostra. . Assim, os pesquisadores podem examinar todas as áreas do cérebro em uma amostra com ISH, enquanto as técnicas de eletroforese só podem olhar para algumas áreas de cada vez.

Medidas de eletroforese não são precisas

Eletroforese em gel pode efetivamente separe proteínas similares com pesos diferentes (esta é uma técnica chamada Western blotting). Pode separá-los mais precisamente através de uma técnica conhecida como eletroforese 2D; isso é comum em proteômica.

Infelizmente, todas as medições feitas a partir desta técnica são semiquantitativas na melhor das hipóteses. A fim de obter a massa precisa (peso) das proteínas, a espectroscopia de massa deve ser empregada após a proteína ter sido purificada por eletroforese. Além disso, a comparação das quantidades relativas de diferentes moléculas depende da densidade de bandas (escuridão) de diferentes pontos no gel. Esse método tem algum grau de erro e as amostras geralmente são executadas várias vezes para obter resultados limpos.

Amostra inicial substancial é necessária

A eletroforese é uma técnica de isolamento e identificação visual de diferentes biomoléculas. Isso é feito passando uma corrente elétrica através do gel para separar moléculas carregadas de diferentes pesos. Se a molécula em que você está interessado não for comum o suficiente, sua banda será virtualmente invisível e difícil de medir.

O DNA e o RNA podem ser amplificados antes de executar a eletroforese, mas não é prático fazer isso. isso com proteínas. Portanto, uma grande amostra de tecido é necessária para executar esses ensaios. Isso pode limitar a utilidade da técnica, especialmente na análise médica. É praticamente impossível executar eletroforese em amostras de uma única célula; citometria de fluxo e imuno-histoquímica são mais comumente usados ​​para avaliar a expressão célula-a-célula de proteínas. Uma técnica chamada PCR é excelente para medir com precisão pequenas quantidades de RNA.

Apenas algumas moléculas podem ser visualizadas. A eletroforese é excelente na separação e identificação de biomoléculas de médio a grande porte. No entanto, muitas das moléculas que os pesquisadores desejam ver são menores; hormônios pequenos, neurotransmissores e íons não podem ser medidos por eletroforese. Isso ocorre por dois motivos: eles não reagem adequadamente com o preparo da eletroforese (geralmente uma técnica chamada SDS PAGE) e, mesmo se o fizessem, eles são muito pequenos para se separarem adequadamente e iriam sair correndo pelo fundo do gel. Em vez disso, essas moléculas são medidas por técnicas como RIAAs (radioimunoensaios) e ELISAs (ensaio imunoenzimático). A eletroforese é de baixo débito. A eletroforese em gel é geralmente de baixa produtividade, ou seja, não produza dados especialmente rapidamente. Eletroforese de contraste, onde você pode observar um pequeno número de moléculas de RNA por vez, com PCR (reação em cadeia da polimerase), que pode avaliar simultaneamente milhares de amostras. Da mesma forma, a citometria de fluxo pode fazer medições a partir de milhares de células individuais e fazer correlações complexas, enquanto a eletroforese observa as células em massa e não pode fazer discriminações tão sutis. A PCR e a citometria de fluxo representam processos massivamente paralelos e seriados, respectivamente, e ambos superam em muito as capacidades da eletroforese para gerar dados de pesquisa.