Células observadas em uma lâmina colocada sob um microscópio são contadas usando uma ferramenta de laboratório comum conhecida como hemacitômetro, ou uma câmara de contagem de células, em conjunto com um corante de exclusão chamado azul de tripano. O corante mancha as células mortas de azul, mas não pode entrar nas células vivas, que aparecerão como esferas brancas brilhantes através da ocular do microscópio. Os cientistas precisam contar as células para colocar o número correto de células em um meio de cultura celular ou reagente experimental para quantificação e análise ou simplesmente para evitar que as células cresçam demais.

Determine o tipo de hemacitômetro (por exemplo, Neubauer) sendo usado. Estas são basicamente lâminas de microscópio espessas contendo uma área central gravada com grades de contagem. Coloque isso sob o microscópio para uma baixa ampliação (10-20X) e ajuste o foco das lentes até que as grades de contagem sejam visíveis.

Prepare uma suspensão de células. Use a enzima tripsina para quebrar o tecido em células individuais e depois neutralizar a tripsina com soro. Lave e sedimente as células e ressuspenda em mídia ou solução salina. Elimine os aglomerados de células, pipetando suavemente para cima e para baixo. Se a suspensão parecer turva, dilua-a ainda mais com soro fisiológico.

Use o azul tripano para excluir as células mortas. Transferir 10-20 microlitros de suspensão de células para um tubo estéril e misturar com o mesmo volume de corante azul de tripano pipetando suavemente. Isso dilui a suspensão de células 1: 2 em azul de tripano.

Prepare o hemaciômetro. Limpe com 70% de etanol, seque ao ar e, em seguida, coloque uma lamela sobre as grades de contagem. No \\ "dreno \\" no topo de cada grade, coloque 10 microlitros de suspensão de células e permitir que o \\ "dreno \\" para puxá-lo sob a lamínula. Repita para essa outra grade de contagem até que ambos tenham uma camada uniforme de suspensão de células.

Conte o número de células usando o contador manual. As células vivas refletirão a luz e parecerão brilhantes, esbranquiçadas e esféricas. Células azuis são mortas ou danificadas e não devem ser contadas, a menos que números de células não viáveis ​​sejam necessários. Repita para todas as 8 linhas de contagem e depois calcule a média. Por exemplo, se 800 células forem contadas em 8 grades, a média por grade será de 100 células.

Calcule a densidade celular na suspensão original. Aplique o número médio de células à seguinte fórmula: Concentração de células = Número médio de células X 10.000 X fator de diluição (= 2, se a diluição for 1: 2) X volume de suspensão (em mililitros, ajuste conforme necessário para microlitros e assim por diante ).

Limpe o hemacitômetro. Lave a suspensão de células, limpe o hemacitômetro com alvejante e /ou isopropanol a 70% ou inunde com etanol a 70%. Deixe secar ou secar com um pano sem fiapos e descarte todas as suspensões de células indesejadas em recipientes de risco biológico.

Aviso

O azul de tripano é um agente mutagênico e mancha permanentemente, portanto assegure-se de que luvas são usadas antes de prosseguir.