Os cientistas usam citometria de fluxo para diferenciar entre diferentes tipos de células ou organismos microscópicos. É uma ferramenta usada em muitas aplicações, como diagnósticos médicos ou patologia forense. Embora esta técnica experimental seja bastante fácil de realizar, a análise dos dados complexos produzidos pelo citômetro de fluxo é mais difícil devido aos múltiplos fatores experimentais e /ou parâmetros do citômetro. Como tal, é de rotina que os dados citométricos sejam visualizados e analisados usando programas profissionais sofisticados, como o CELLQuest ou o FlowJo. A familiaridade com técnicas de citometria de fluxo, maquinário e software é necessária para entender os resultados produzidos por esses experimentos.
Entendendo os dados da citometria de fluxo
Esclareça o objetivo da experiência perguntando: "O que foi a questão ou hipótese que está sendo investigada? " Isso será necessário para ajustar os resultados brutos ao formato e configurações apropriados para análise posterior usando o software de citometria estatística. Faça as alterações necessárias para que os dados sejam exibidos com as configurações relevantes (por exemplo, células positivas, portas negativas, intensidade de fluorescência, populações de células etc.).
Encontre portas. As células podem ser agrupadas ou simplesmente observadas agrupadas em um gráfico de densidade ou de contorno. Os grupos geralmente se separam dependendo de sua identidade. Se um grupo mancha muito intensamente para um determinado marcador ou anticorpo, conclui-se que os membros desse grupo têm a identidade do tipo específico de célula, que expressa esse marcador. É comum encontrar células que são positivas para mais de um desses marcadores, e essas células geralmente são intermediárias e indicadas como "duplamente positivas".
Veja os gráficos de dispersão. A maneira como os grupos de células espalhados em um gráfico de dispersão é uma indicação do tamanho das células. Células com dispersões muito grandes ou altas são tipicamente células grandes; no entanto, eles podem ser grandes simplesmente porque contêm uma alta proporção de citoplasma, ou podem ser altos porque têm um núcleo muito grande. Dependendo da biologia que está sendo investigada, isso naturalmente variará muito entre os experimentos.
Veja os números. Ajuste os gráficos para exibir diferentes parâmetros em um eixo (geralmente o eixo X) enquanto mantém as contagens no eixo Y. Isto indica a proporção da população da amostra que é positiva para aquele parâmetro em particular, como um pico será normalmente observado em uma amostra corada positivamente, a qual estará ausente da amostra de controle negativo.
Olhe para múltiplas amostras. histogramas de parâmetros. Ajustando o eixo X e o eixo Y para cada um deles representa um parâmetro diferente que foi investigado durante o experimento, é possível obter uma compreensão mais profunda das propriedades da amostra. Por exemplo, definindo o eixo X para fluorescência vermelha e o eixo Y para fluorescência verde, portas de estilo quadrante podem ser calculadas para a amostra para mostrar quatro regiões de um quadrante nas quais as células estão presentes e coradas para vermelho ou verde fluorescência, ambas as cores, ou nenhuma. Isso permite que uma amostra heterogênea seja dividida em suas partes componentes e quaisquer entidades sobrepostas sejam visualizadas e quantificadas.
