O projeto genético de uma célula é codificado em seu material genético, ou DNA. Como o DNA nunca deixa o núcleo da célula, para que essa informação entre no citoplasma, onde outras proteínas e componentes bioquímicos residem, é necessário primeiro transcrever o DNA em RNA mensageiro (mRNA ou poli (A) RNA). Este mRNA então se traduz em proteínas que realizam muitas funções da célula. Para detectar ou quantificar mRNAs muito raros, fazer sondas para microarranjos ou construir bibliotecas de moléculas de DNA complementares, o mRNA deve ser isolado. No entanto, a extraco de ARN total (i.e., todo o ARN numa cula) e subsequente isolamento de ARNm n s processos mutuamente exclusivos; o primeiro deve ser realizado para que o mRNA seja extraído.
Isolamento do mRNA do RNA total
Homogeneização do TRIzol: O RNA total inclui todo o mRNA, RNA de transferência, RNA ribossômico e outros RNAs não-codificantes . Para separar estes de outros componentes celulares, a célula é primeiro aberta para libertar o seu conteúdo. Isto é feito ressuspendendo as células sedimentadas por centrifugação (centrifugação a altas velocidades) em TRIzol Reagent (Life Technologies). Outras versões do TRIzol (como o Reagente TRI da Ambion) funcionam de forma semelhante.
Isolamento do RNA total: Uma série de centrifugações é usada para separar os diferentes componentes (proteínas, DNA, RNA) da célula em camadas ou fases. , dentro da suspensão. A fase superior, de cor amarela, é composta de gordura e pode ser descartada. A fase desejada é tingida de vermelho, contém o RNA total e é retida. Depois de realizar uma extração com fenol-clorofórmio e uma série de lavagens com álcool usando isopropanol e etanol, o RNA pode ser sedimentado para isolamento de mRNA. Adicionar inibidores de RNase para evitar que esta enzima degrada o RNA total.
Extração de mRNA: É comum usar um kit para isolar mRNAs, pois os protocolos de laboratório caseiros não geram grandes quantidades de mRNAs altamente purificados. Os kits comerciais incluem o FastTrack 2.0 da Invitrogen ou o kit de isolamento de mRNA Poly (A) Pure da Ambion. Estes passos básicos são comuns a tais kits:
a) Misture o tampão de lise inibido por RNase fornecido no kit com até 300 microlitros de RNA total.
b) Aqueça por 5 minutos a 65 graus Celsius e, em seguida, resfriar imediatamente a amostra em gelo por um minuto.
c) Misture com cloreto de sódio 0,5 M e dissolve-se completamente Oligo dT (ácido oligodesoxitimidílico) nesta amostra.
d) Centrifugue esta amostra e recupere o sobrenadante, que é lavado várias vezes em uma série de tampões de baixa ligação e sal fornecidos nos kits.
e) elute o mRNA várias vezes até que um volume especificado pelo kit (por exemplo, 500 microlitros) é obtido.
f) Precipitar o eluato por acetato de sódio e precipitação com etanol. Re-suspender em até 20 microlitros de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC).
g) Armazenar a -80 graus Celsius e verificar a qualidade e quantidade por espectrofotometria.
Dica
Mantenha todos os reagentes, células e RNA frios submergindo no gelo. Isso evita que o RNA seja degradado por quaisquer outras enzimas liberadas durante o processo de homogeneização.
Aviso
Reagentes como TRIzol são tóxicos e não devem estar em contato com a pele ou membranas mucosas. Sempre observe protocolos laboratoriais seguros ao manusear este reagente.
