Quantifique sua amostra de RNA medindo sua absorção de luz ultravioleta (UV). Um espectrofotômetro de nano-gotas usará apenas um ou dois microlitros de sua amostra, que você pode recuperar. Outros espectrofotômetros exigem uma amostra muito maior. O coeficiente de extin�o para nucle�idos a um comprimento de onda UV de 260 nm num percurso de luz de 1 cm �de 20. Com base neste coeficiente de extin�o, a absorv�cia de 40 � /mL de ARN nas mesmas condi�es �um. Usando essa informação, você pode calcular a concentração da sua amostra de RNA.

Faça uma diluição, se necessário, da sua amostra. Uma diluição padrão para uma microcuveta é 1:40. Faça essa diluição adicionando 2µL de amostra de RNA a 78µL de água estéril.

Siga os protocolos do seu espectrofotômetro específico para calibrar a máquina usando um branco e depois determine a densidade óptica de sua amostra em um comprimento de onda UV de 260nm.

Multiplique a absorvância da sua amostra pelo seu fator de diluição por 40μg de RNA /mL. A equação seria: “Concentração de RNA (µg /ml) = (OD260) x (fator de diluição) x (40 µg RNA /ml) /(1 unidade OD260)” (Hofstra.edu) Por exemplo: Se você diluiu sua amostra por 1:40 e sua leitura de absorbância era 0,08, você multiplicaria 0,08 x 40 x 40 = 128 µg /ml = 0,13 µg /μL

Descobrir a pureza da sua amostra tomando outra leitura de absorbância no comprimento de onda de 280nm UV . A razão OD 260 /OD 280 indicará se - e em que nível - sua amostra está contaminada com proteína ou fenol. Um resultado de 1,8 a 2,0 indica RNA de qualidade.

Dica

Não se esqueça de calibrar seu espectrofotômetro. A execução de um gel eletroforético rápido confirmará os resultados das especificações.

Aviso

Não presuma que sua amostra seja pura. Tomando o tempo para uma relação OD260 /OD280 economiza tempo e dinheiro na estrada.