p (Phys.org) —Ao carregar qualquer proteína específica e ácido nucleico em uma nanopartícula à base de capsídeo de fago T4 icosaédrica, os ligantes do veículo de entrega de células resultantes podem se ligar à superfície de tecidos alvo específicos para entregar a carga de proteína / DNA. (Nanopartículas virais icosaédricas são conchas de proteínas evolutivas montadas em uma ordem hierárquica que resulta em uma camada de proteína estável e um espaço interno para acomodar ácidos nucléicos e proteínas; um capsídeo é a concha de proteína de um vírus.) A técnica tem drogas e genes aplicações de entrega em doenças humanas, diagnóstico e imagem celular, e outras áreas médicas. Recentemente, cientistas do Laboratório de Pesquisa Naval dos EUA, Washington, DC e Universidade de Maryland em Baltimore embalaram nanopartículas de T4 na Vivo com recombinação cíclica ativa, ou Cre, recombinase (uma enzima de recombinação genética usada para manipular a estrutura do genoma e controlar a expressão do gene) e em vitro com mCherry fluorescente (uma proteína fluorescente usada como um marcador quando marcada para moléculas e componentes celulares) de expressão de DNA de plasmídeo, e entregou essas nanopartículas nas células cancerosas:Quando liberadas nas células na presença de DNA e proteína, a recombinase aumenta a expressão de mCherry por circularização (isto é, mudar o DNA linear empacotado em um loop circular). Os pesquisadores afirmam que este empacotamento eficiente e específico em cápsides e o desempacotamento de DNA e proteína com liberação de complexos de proteína / DNA enzimaticamente alterados das nanopartículas em células têm potencial em inúmeras aplicações downstream, como terapia genética e de câncer. p Dr. Jinny L. Liu discutiu o artigo que ela, Prof. Lindsay W. Black e seus co-autores publicados em Anais da Academia Nacional de Ciências dos EUA . "Nanopartículas virais icosaédricas são essencialmente nanocontêineres de 100 nm por 80 nm que permitem que o material genético exógeno seja embalado em vitro através da maquinaria de ácido nucleico que geralmente só permite que DNA / RNA linear seja empacotado por meio de um canal portal, "Liu conta Phys.org . "Contudo, em vitro o empacotamento de proteínas é geralmente impossível, porque para a maioria das nanopartículas virais não há maquinário de empacotamento de proteína comparável ao maquinário de empacotamento de ácido nucleico ". Embora a proteína possa ser quimicamente reticulada à superfície interna do capsídeo, espera-se que isso leve à desnaturação das proteínas e perda da atividade enzimática.

p Dito isso, a natureza desenvolveu soluções para este enigma do empacotamento de proteínas. No decorrer na Vivo montagem do capsídeo viral, Liu explica, alguns vírus bacterianos, ou bacteriófagos, proteínas alvo dentro dos procapsídeos antes o ácido nucleico é empacotado de modo a ejetar as proteínas com o ácido nucleico, facilitando assim a infecção em conjunto com o ácido nucleico. (Um procapsídeo, ou prohead, é uma estrutura de capsídeo viral imatura formada nos estágios iniciais de automontagem de alguns bacteriófagos. A produção e montagem de proheads estáveis ​​é um precursor essencial para o empacotamento do genoma do bacteriófago.) Apenas alguns fagos foram bem caracterizados na Vivo sistemas de empacotamento de proteínas, e o fago T4 é o mais bem caracterizado. "O laboratório do Prof. Black no UMB e o meu laboratório no NRL demonstraram que não apenas uma enzima estranha específica - recombinação cíclica (Cre) recombinase - pode ser empacotada no capsídeo na Vivo , mas também que é ativo dentro do capsídeo. ”Esta atividade foi demonstrada mostrando a religação (a reintegração de duas fitas de DNA ou outras moléculas por uma ligação de éster de fosfato) de DNA linear empacotado flanqueado com dois locais de recombinação Cre.

p O artigo mostra que o espaço substancial dentro de um nanocontêiner de T4 acomoda a enzima Cre ativa junto com o DNA exógeno. "Para aplicações potenciais, T4 pode empacotar até 50 kb de DNA linear exógeno contendo genes desejados de comprimento total junto com recombinases, proteínas Cre ou λ-red, para recombinação homóloga específica dentro do cromossomo, "Liu observa. ( Recombinação homóloga é um tipo de recombinação genética em que as sequências de nucleotídeos são trocadas entre duas moléculas de DNA semelhantes ou idênticas.) "Esperamos que a enzima cas9 possa ser encapsidada de uma forma comparável - e de fato, pelo menos oito proteínas diferentes foram encapsidadas desta maneira. Por meio de recombinação homóloga, nosso sistema pode permitir que o gene corrigido substitua o gene mutado em sua localização original no cromossomo ou eliminando precisamente os genes hiperativos nas células-tronco. "Liu destaca que o vetor de entrega T4 é mais seguro e melhor controlado do que outro gene de entrega viral terapia, tais como aqueles que entregam genes usando vetores virais de animais infecciosos para inserir aleatoriamente o gene dentro do cromossomo.

p Em seu jornal, os autores relatam que a expressão do gene NP do capsídeo de T4 e o sistema de entrega de proteínas podem ser complementares ou usados ​​em conjunto com a terapia gênica baseada em RNA Cas e nuclease taran. (Os genes Cas codificam para proteínas relacionadas a loci de DNA contendo repetições curtas de sequências de base conhecidas como Repetições Palindrômicas Curtas com Espaçamento Intercalado Regularmente Agrupado, ou CRISPRs.) "O sistema de expressão de nanopartículas de T4 pode facilmente complementar Cas9 e recombinação baseada em nuclease taran, empacotando o cas9 linear, DNA de plasmídeo sgRNA alvo, e Cre recombinase - ou mesmo ligase, uma enzima que facilita a união de fitas de DNA - e entrega as nanopartículas de T4 resultantes nas células eucarióticas receptoras com alta especificidade empregando SOC e HOC, "Liu conta Phys.org . (SOC e HOC são proteínas da cápside T4 dispensáveis.) "Ao exibir os ligantes de direcionamento (moléculas de ligação) na superfície, a expressão do gene do capsídeo de T4 e o sistema de proteína serão capazes de entregar com eficiência os plasmídeos Cas9 e sgRNA juntos nas células receptoras desejadas. Proteínas Cas9 enzimaticamente ativas relevantes, exonuclease lambda, A proteína lambda beta e outras podem ser entregues diretamente ao mesmo tempo a partir da nanopartícula de T4. "

p Liu acrescenta que seu laboratório também tem estudado imagens de células e entrega de drogas / genes para células eucarióticas usando nanopartículas T4 sem cauda, que os pesquisadores demonstraram pode entrar nas células eucarióticas sem causar a morte celular.

p Um exemplo específico de potenciais aplicações terapêuticas de drogas e genes a jusante resultantes da nova abordagem é a entrega da proteína tóxica e plasmídeo linear que produz peptídeos neutralizantes ou anticorpos em células cancerosas direcionadas exibindo marcadores específicos de câncer usando proteínas de ligação ao marcador SOC + HOC de alta afinidade no superfície das cápsides, enquanto outro exemplo é usar o sistema para terapia gênica de HIV.

p Liu acrescenta que existem várias maneiras de usar este sistema para terapia genética:

• Entrega de nanopartículas de T4 empacotadas com a recombinase (ou ligase) e DNA de plasmídeo linear para produzir gp120 ou interferon para gerar ou aumentar a resposta imune em pacientes
• Entrega de nanopartículas de T4 empacotadas com recombinase (ligase) e o DNA do plasmídeo de expressão de CD40 solúvel linear em linfócitos T ou células hematopoiéticas para bloquear a infecção de HIV-1
• A inibição do RNA através da entrega do DNA de plasmídeo projetado que pode produzir RNA chamariz para se ligar ao DNA de sentido viral
• Proteína de inibição pela entrega de anticorpos antivirais empacotados e DNA de plasmídeo de anticorpo anti-HIV

p Além de diagnóstico e imagem celular, o sistema de proteína-gene de nanopartículas de T4 pode entregar genes reparados para corrigir doenças genéticas humanas - por exemplo, reverter a deficiência de adenosina desaminase (ADA) pela introdução do complexo proteína-DNA para expressar ADA em células-tronco. Outras áreas amplas de pesquisa impactadas por tecnologias de terapia genética, como defeitos genéticos, Câncer, doenças neurológicas em adultos, e envelhecer, também pode se beneficiar deste estudo.

p Seguindo em frente, os cientistas querem desenvolver mais pró-capsídeos T4 que empacotam exonucleases e outras recombinases, juntamente com DNA alvo projetado para demonstrar que os capsídeos T4 resultantes podem inserir o gene em uma linhagem de células-tronco com deficiência genética. "Além disso, "Liu conclui, "estamos trabalhando na adaptação de nosso sistema para entregar peptídeos terapêuticos ou anticorpos às células expostas ou infectadas por agentes biológicos, como toxinas de proteínas ou vírus, neutralização eficiente dos efeitos das toxinas. O tratamento e a cura de células e tecidos expostos a esses agentes são de grande interesse para nossa comunidade de pesquisa em biodefesa. " p © 2014 Phys.org