Um novo tipo de superresolução para explorar a divisão celular
Princípio do nanoscópio de intensidade de fase não branqueador, PINE, para matéria viva. um PI de intensidade de fase:Filme fino multicamadas de intensidade de fase integrado, composto de álcool polivinílico/polímeros cristalinos líquidos, permite o controle preciso das diferenças de fase entre os componentes do campo elétrico. A luz dispersa é remodelada de acordo com a modulação de fase. A modulação de fase é então convertida em modulação de intensidade, de modo que a variação de intensidade resultante corresponda a subconjuntos de nanossondas que marcam arquiteturas celulares. b Conceito de PINE:(i) PI modula com precisão as diferenças de fase δn correspondendo a subconjuntos de nanossondas Nn dentro da população. N :número de nanossondas. δ :diferença de fase entre componentes do campo elétrico. (ii) Nanossondas distribuídas aleatoriamente (nanobastões de Au) formam padrões das arquiteturas celulares subjacentes. Usando PI, as nanossondas exibem diferenças de fase entre os componentes do campo elétrico de maneira estocástica. (iii) O PINE abre uma janela de investigação de longa data para investigar a dinâmica emergente da nanoescala para a macroescala:na divisão celular, a reorganização de constituintes individuais na nanoescala emerge em movimentos de nível de grupo e mudanças de forma na macroescala ao longo do tempo. c Configurar. A configuração de campo escuro ilumina uma amostra marcada com nanossonda (S) em uma câmara de fluxo controlada por temperatura e gás. A luz espalhada coletada por objetivo (O) é modulada por intensidade de fase (PI) e filtrada por passagem de banda (BP). Para aumentar a ampliação do sistema, foram adicionadas lentes relé (RL) para aumentar a distância focal efetiva da lente tubular (L). Após a separação da intensidade de fase, a variação de intensidade resultante corresponde a subconjuntos de nanossondas. d Métodos de super-resolução de fluorescência, como depleção do estado fundamental (GSD), depleção de emissão estimulada (STED), microscopia de localização fotoativada (PALM) e microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), levaram a resolução espacial além do limite de difração (y -axis) (tabela completa com informações de suporte Fig. S1). O PINE cria novas oportunidades nanoscópicas ao longo do eixo do tempo (eixo x) para investigações que exigem janelas de observação de longo prazo. Crédito:Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39624-w Uma nova maneira de ver detalhes menores que metade do comprimento de onda da luz revelou como a estrutura em nanoescala dentro das células faz a ponte para a macroescala durante a divisão celular. Ao contrário das técnicas anteriores de superresolução, a desenvolvida e testada na Universidade de Michigan não depende de moléculas que se desgastam com o uso prolongado.
A superresolução pode revelar estruturas de até 10 nanômetros, ou aproximadamente a mesma largura de 100 átomos. Abriu um mundo totalmente novo na biologia, e as técnicas que o tornaram possível receberam o Prémio Nobel em 2014. No entanto, o seu ponto fraco é que só consegue tirar fotografias ao longo de dezenas de segundos. Isto torna impossível observar a evolução da maquinaria de uma célula durante longos períodos de tempo.
"Estávamos nos perguntando:quando o sistema como um todo está se dividindo, como as estruturas em escala nanométrica interagem com seus vizinhos em escala nanométrica e como essa interação se estende a toda a célula?" perguntou Somin Lee, professor assistente de engenharia elétrica e de computação da U-M, que liderou o estudo publicado na Nature Communications .
Para responder a essa pergunta, Lee e colegas precisavam de um novo tipo de superresolução. Usando seu novo método, eles conseguiram monitorar continuamente uma célula por 250 horas.
"A célula viva é um lugar movimentado com proteínas movimentadas aqui e ali. Nossa superresolução é muito atraente para visualizar essas atividades dinâmicas", disse Guangjie Cui, Ph.D. estudante de engenharia elétrica e de computação e coautor do estudo com Yunbo Liu, Ph.D. licenciado em engenharia electrotécnica e de computadores.
Assim como o método original, a nova técnica usa sondas próximas aos objetos de interesse em nanoescala para iluminá-los. A Superresolução 1.0 usou fluoróforos para isso, moléculas fluorescentes que enviariam uma luz de resposta após serem iluminadas. Se os fluoróforos estivessem mais próximos do que o tamanho do que estava sendo visualizado, a imagem poderia ser reconstruída a partir das explosões de luz produzidas pelos fluoróforos.
A nova técnica utiliza nanobastões de ouro, que não se quebram com a exposição repetida à luz, mas fazer uso da luz que interage com eles é mais desafiador. Os nanobastões respondem à fase da luz, ou onde ela está na oscilação para cima e para baixo dos campos elétricos e magnéticos que os compõem. Essa interação depende de como o nanobastão está inclinado em relação à luz que entra.
Assim como os fluoróforos, os nanobastões podem se fixar em estruturas celulares específicas com moléculas direcionadas em suas superfícies. Nesse caso, os nanobastões buscaram a actina, proteína que dá estrutura às células moles. A actina tem a forma de filamentos ramificados, cada um com cerca de 7 nanômetros (milionésimos de milímetro) de diâmetro, embora se liguem para abranger milhares de nanômetros. Embora os nanobastões tenham frequentemente mais do que o dobro do diâmetro da actina, os dados que fornecem como grupo podem iluminar os seus pequenos detalhes.
Para localizar os nanobastões, a equipe construiu filtros feitos de finas camadas de polímeros e cristais líquidos. Esses filtros permitiram a detecção de luz com uma fase específica, permitindo à equipe selecionar nanobastões com ângulos específicos em relação à luz recebida. Ao tirar de 10 a 30 imagens – cada uma olhando para um subconjunto diferente de nanobastões – e fundi-las em uma única imagem, a equipe foi capaz de deduzir os detalhes em escala nanométrica dos filamentos dentro das células. Esses detalhes ficariam borrados em microscópios convencionais.
Usando a técnica, a equipe descobriu três regras que regem a forma como a actina se auto-organiza durante a divisão celular:
A actina se expande para alcançar seus vizinhos quando os filamentos de actina estão distantes.
A Actin se aproximará de seus vizinhos para aumentar as conexões, embora essa tendência seja atenuada pelo desejo de expandir e alcançar mais vizinhos.
Como resultado, a rede actina tende a se contrair quando está mais conectada e a se expandir quando está menos conectada.
O comportamento da actina está ligado ao comportamento da célula – mas a célula se contrai quando a actina se expande e se expande quando a actina se contrai. A equipe quer explorar isso mais a fundo, descobrindo por que os movimentos são opostos em diferentes escalas. Eles também querem investigar as consequências da desregulação deste processo molecular:estará isto na origem de algumas doenças?
De forma mais ampla, eles esperam usar a superresolução para compreender como a auto-organização é incorporada nas estruturas biológicas, sem a necessidade de controle central.
“Nosso código genético não inclui informações suficientes para codificar todos os detalhes do processo organizacional”, disse Lee. “Queremos explorar os mecanismos de comportamentos coletivos sem coordenação central que são como pássaros voando em formação – nos quais o sistema é impulsionado por interações entre partes individuais”.
Mais informações: Guangjie Cui et al, Nanoscópio de intensidade de fase (PINE) abre janelas de investigação de longa data da matéria viva, Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39624-w Informações do diário: Comunicações da Natureza
