Pesquisadores da Escola de Engenharia McKelvey da Universidade de Washington em St. Louis foram os pioneiros em uma nova técnica que permitirá imagens de alta resolução de objetos muito pequenos, como neurônios. A técnica, que aprimora um método existente chamado microscopia de expansão, é descrita em um novo artigo publicado na revista Nano Letters .



A maioria das pessoas está familiarizada com microscópios que usam lentes para fazer um objeto parecer maior e mais fácil de ver pelo olho humano. Mas a microscopia de expansão (ExM) funciona praticamente de maneira oposta – tornando o próprio objeto maior. Os cientistas revestem a amostra – uma célula, por exemplo – com pequenos marcadores emissores de luz chamados fluoróforos e depois incorporam a amostra num gel que se expande quando entra em contacto com a água. À medida que a amostra cresce, os rótulos fluorescentes traçam os contornos de características demasiado pequenas para serem vistas, como os ramos finos, ou dendritos, que crescem a partir das células cerebrais.

Mas a microscopia de expansão tem uma grande deficiência. O sinal luminoso emitido pelos fluoróforos convencionais perde grande parte da sua intensidade (mais de 50%) durante as etapas de preparação e expansão.

“Quando você aumenta as coisas, não é necessariamente bom, porque se você não alterar a quantidade de sinal que já está presente, esse sinal fica mais fraco”, disse Barani Raman, professor de engenharia biomédica.

Raman e Srikanth Singamaneni, professor Lilyan &E. Lisle Hughes do Departamento de Engenharia Mecânica e Ciência dos Materiais, abordaram esta questão usando marcadores fluorescentes ultrabrilhantes chamados fluores plasmônicos (PFs). Singamaneni desenvolveu os PFs para outras aplicações em 2020.

"É um bom exemplo de duas pessoas com conhecimentos completamente diferentes tendo uma conversa casual e dizendo:'Ok, esse problema está aqui em um campo, mas a solução está em outro campo'", disse Raman. A equipe apelidou sua nova técnica "microscopia de expansão aprimorada por plasmon" ou p-ExM.

O fluoróforo plasmônico é construído a partir de uma partícula central de ouro envolta em uma concha de prata, que é então coberta com uma camada de outros materiais, incluindo fluoróforos convencionais. A estrutura foi projetada para proteger os fluoróforos dos produtos químicos agressivos usados ​​no processo e para tornar o sinal de luz dos fluoróforos muito mais brilhante. A técnica ajudará os pesquisadores no mapeamento de redes neurais, ou seja, nas conexões entre os neurônios.

“A nanopartícula metálica serve como antena, o que significa que é capaz de atrair mais luz para os fluoróforos”, disse Singamaneni. A interação entre a nanopartícula de ouro-prata e os fluoróforos também faz com que os fluoróforos emitam mais fótons do que normalmente emitiriam. Como resultado, o fluor plasmônico é quase quatro ordens de magnitude mais brilhante do que os marcadores fluorescentes seriam por si só. Os fluores plasmônicos também resolvem o problema da diluição do sinal porque os marcadores fluorescentes são ligados diretamente à nanopartícula, de modo que não se espalham quando a amostra se expande.

Para demonstrar o potencial da microscopia de expansão aprimorada por plasmons, os pesquisadores a usaram para estudar uma amostra de neurônios da região do hipocampo do cérebro. Em alguns casos, os ramos emergentes do neurônio, chamados neurites, estão muito próximos uns dos outros para serem identificados sem a ajuda de técnicas como a microscopia de expansão.

“Quando duas neurites estão muito próximas uma da outra, não podemos resolvê-las. O software pensa que são apenas uma neurite”, disse Singamaneni.

Depois de rotular as células com fluores plasmônicos ultrabrilhantes e expandir a amostra, a equipe conseguiu contar o número de neurites, quantificar a área total das neurites e medir o comprimento de neurites individuais. Eles identificaram 2,5 vezes mais pontos terminais de neurites do que eram visíveis antes da expansão da amostra.

Quando a equipe comparou o desempenho do fluoróforo plasmônico com os próprios fluoróforos, eles descobriram que o fluoróforo plasmônico retinha cerca de 76% do sinal de luz, enquanto os fluoróforos retinham menos de 16%. Os resultados da equipe também mostraram que a microscopia de expansão aprimorada por plasmon é compatível com os protocolos de microscopia de expansão existentes, o que significa que os fluors plasmônicos podem ser usados ​​no lugar dos fluoróforos convencionais em estudos futuros. Os PFs também podem ser criados a partir de qualquer fluoróforo que atenda às necessidades dos pesquisadores.

Mais informações: Priya Rathi et al, Microscopia de Expansão Aprimorada por Plasmon, Nano Letras (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256
Informações do diário: Nanoletras

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