As transfusões de plaquetas são essenciais no manejo do sangramento e da disfunção hemostática e podem ser expandidas para serem usadas como terapia celular para uma variedade de doenças. Os esforços para criar tais terapias celulares exigem que os pesquisadores modifiquem as plaquetas do doador para expressar proteínas terapêuticas. No entanto, actualmente, os métodos apropriados para modificar geneticamente as plaquetas recolhidas de dadores de sangue permanecem indefinidos.



Em um novo estudo publicado na Science Advances , Jerry Leung, e uma equipe de cientistas em nanomedicina, bioquímica e biologia molecular da Universidade de British Columbia, no Canadá, da Universidade de Hokkaido, no Japão, e de várias instituições nos EUA descreveram uma abordagem baseada em nanopartículas lipídicas otimizadas para plaquetas contendo mRNA para expressão de proteínas exógenas em plaquetas humanas e de ratos.

Quando a equipe testou a biblioteca de nanopartículas lipídicas de mRNA, a expressão proteica exógena resultante não se correlacionou com a ativação plaquetária. As plaquetas transfectadas mantiveram a função hemostática e acumularam-se em áreas de dano vascular após transfusão em ratos com capacidade de expandir o potencial terapêutico das plaquetas.

Plaquetas e hemostasia

As plaquetas são essenciais para a hemostasia e são transfundidas rotineiramente para restaurar o equilíbrio hemostático nos pacientes. Essas plaquetas podem ser expandidas além de indicações como terapias celulares para tratar sepse, inflamação e artrite. As plaquetas geneticamente modificadas podem criar novas terapias celulares que expressam proteínas terapêuticas, que podem ser implementadas para modificar as plaquetas do doador. Os métodos existentes de eletroporação, vetores virais e transfecção comercial não foram capazes de editar plaquetas de doadores e expressar proteínas exógenas.

Abordagens indiretas podem expressar proteínas exógenas em plaquetas ou partículas semelhantes a plaquetas, visando células-tronco precursoras de plaquetas com vetores lentivirais. As plaquetas derivadas de doadores devem ser modificadas funcionalmente para criar terapias celulares plaquetárias autênticas.

Tentativas anteriores de transfectar plaquetas com nanopartículas lipídicas contendo mRNA mostraram a possibilidade de entrega de mRNA nas plaquetas, enquanto os avanços na tecnologia de nanopartículas lipídicas melhoraram seu potencial para atingir um público mais amplo.

Neste trabalho, Leung e colegas relataram nanopartículas lipídicas de mRNA por sua capacidade de transfectar diretamente plaquetas de doadores para expressar proteínas exógenas. Tais plaquetas podem ser modificadas com nanopartículas lipídicas de mRNA para manter sua função e acumular-se localmente em feridas e regular a homeostase após transfusão em ratos coagulopáticas.

Nanopartículas lipídicas facilitam a expressão de proteínas exógenas nas plaquetas

Para identificar os métodos eficazes de transfecção para plaquetas, a equipe entregou mRNA que codifica uma enzima NanoLuc luciferase (NanoLuc) usando vários agentes de transfecção e mediu sua expressão. Embora o NanoLuc não tenha sido detectado em plaquetas tratadas com mRNA livre sem agente de transfecção ou usando agentes comerciais de distribuição de mRNA, o processo permitiu a absorção de grandes quantidades de mRNA nas plaquetas.

Leung e sua equipe detectaram a expressão de NanoLuc usando uma formulação de nanopartículas lipídicas de mRNA que se assemelhava à pequena nanopartícula lipídica de RNA interferente clinicamente comprovada para tratar a amiloidose hereditária. A equipe comparou a quantidade de ativação plaquetária após a transfecção de nanopartículas lipídicas de mRNA com plaquetas não tratadas.

Para identificar a formulação de nanopartículas lipídicas de mRNA mais adequada para o transporte de plaquetas, eles otimizaram três componentes principais; lipídios ionizáveis, lipídios ligantes e o lipídio polietilenoglicol. Eles examinaram 10 lipídios ionizáveis ​​e dois permanentemente catiônicos e mediram sua expressão proteica, absorção de mRNA e ativação para apoiar a síntese protéica.

Ações das nanopartículas lipídicas funcionalizadas em laboratório

Para examinar como a combinação de lipídios ionizáveis ​​e auxiliares tem efeitos sinérgicos para aumentar a expressão proteica e, ao mesmo tempo, minimizar a ativação plaquetária, a equipe estudou dois lipídios ionizáveis ​​aprovados pela FDA. Além de sua composição lipídica, os elementos de mRNA desempenharam um papel significativo na promoção da síntese protéica exógena eficiente. As nanopartículas lipídicas contendo lipídios auxiliares com cabeça de fosfocolina, juntamente com lipídios com grupos de cauda ramificados ou insaturados, foram mais adequadas para transfecção de plaquetas e para gerar níveis de expressão mais elevados.

Das modificações de RNA testadas neste trabalho, Leung e colegas observaram que a uridina não modificada ou a pseudouridina facilitam níveis mais elevados de expressão de fluorescência. Eles então observaram se a expressão da fluorescência dependia do grau de ativação plaquetária ou da quantidade de RNA entregue, que estudaram usando uma análise de matriz de correlação.

Embora a expressão de fluorescência não tenha se correlacionado fortemente com os níveis de plaquetas na superfície ou com a captação de mRNA, eles notaram uma correlação positiva moderada entre a quantidade de RNA entregue e a ativação plaquetária. Como a expressão de NanoLuc não se correlacionou fortemente com os níveis de plaquetas superficiais ou com a captação de mRNA, a equipe testou a possibilidade de influenciar sua expressão ativando plaquetas usando agonistas antes e depois da transfecção de nanopartículas lipídicas de mRNA.

Tratamento plaquetário para modelar coagulopatia dilucional

As plaquetas estimuladas com difosfato de adenosina, por exemplo, peptídeo relacionado ao colágeno reticulado ou trombina antes do tratamento com nanopartículas lipídicas de mRNA, tiveram significativamente menos expressão de fluorescência. Quando Leung e a equipe estimularam plaquetas com agonistas por mais de duas horas, eles passaram por um rearranjo substancial do transcriptoma e do proteoma. Os resultados mostraram que a tradução do mRNA exógeno não exigiu ativação plaquetária.

Quando a equipe tratou plaquetas com nanopartículas lipídicas de mRNA, elas mantiveram a função hemostática in vitro e mostraram alta sensibilidade aos seus ambientes físicos e químicos. A equipe investigou se as plaquetas ainda poderiam ser ativadas após a transfecção de nanopartículas lipídicas de mRNA e mediram seu estado de ativação e resposta a agonistas fisiológicos.

A equipe testou a capacidade das plaquetas transfectadas de reter seu potencial de contribuir para a firmeza e a taxa de formação de coágulos usando um modelo de tromboelastometria rotacional e um modelo ex vivo para testar a atividade plaquetária no sangue total. Os pesquisadores modelaram a coagulopatia dilucional usando sangue total diluído e plaquetas preparadas em um pacote de transfusão.

Quando combinaram o pacote de transfusão com sangue total diluído para modelar a doença tal como ocorre num paciente, notaram que as nanopartículas lipídicas não afetaram a coagulopatia plaquetária in vitro. Além disso, a equipe explorou a expressão de plaquetas transfectadas com nanopartículas lipídicas de mRNA expressas com NanoLuc, circuladas e localizadas em locais de feridas após transfusão em roedores coagulopáticas.

Perspectiva

Desta forma, Jerry Leung e colegas direcionaram a entrega de moléculas e terapias celulares em locais de interesse da vasculatura, usando plaquetas naturalmente competentes que podem executar inerentemente esta tarefa. A equipe desenvolveu nanopartículas lipídicas otimizadas para plaquetas e mRNA para expressão proteica bem-sucedida, ao mesmo tempo que apresentava função circular plaquetária e acúmulo local no local da vasculatura de interesse.

É possível obter a entrega de ácidos nucleicos e a tradução exógena usando nanopartículas lipídicas de mRNA otimizadas para plaquetas para ampliar e projetar plaquetas para uma variedade de aplicações clínicas. Essas plaquetas doadas projetadas com nanopartículas lipídicas de mRNA podem tratar distúrbios hemorrágicos agudos com aplicações mais amplas em oncologia. Essas plaquetas transfundidas com nanopartículas lipídicas de mRNA otimizadas são funcionalmente transfusíveis e podem se acumular no local da vasculatura para terapias plaquetárias eficazes para modular distúrbios hematológicos.

Mais informações: Jerry Leung et al, Plaquetas transfusáveis ​​geneticamente modificadas usando nanopartículas lipídicas de mRNA, Science Advances (2023). DOI:10.1126/sciadv.adi0508
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