Pesquisadores da Universidade Ludwig Maximilian (LMU) desenvolveram um método inovador para rastrear simultaneamente processos dinâmicos rápidos de múltiplas moléculas em escala molecular.



Os processos dentro do nosso corpo são caracterizados pela interação de várias biomoléculas, como proteínas e DNA. Esses processos ocorrem em uma escala geralmente dentro da faixa de apenas alguns nanômetros. Consequentemente, não podem ser observados com microscopia de fluorescência, que tem um limite de resolução de cerca de 200 nanômetros devido à difração.

Quando dois corantes marcando posições de biomoléculas estão mais próximos do que este limite óptico, sua fluorescência não pode ser distinguida ao microscópio. Como esta fluorescência é usada para localizá-los, torna-se impossível determinar com precisão suas posições.

Este limite de resolução tem sido tradicionalmente superado em métodos de microscopia de super-resolução, fazendo os corantes piscarem e ligando e desligando sua fluorescência. Isto separa temporariamente a sua fluorescência, tornando-a distinguível e permitindo localizações abaixo do limite de resolução clássico.

Porém, para aplicações que envolvem o estudo de processos dinâmicos rápidos, esse truque tem uma desvantagem significativa:piscar impede a localização simultânea de múltiplos corantes. Isto diminui significativamente a resolução temporal ao investigar processos dinâmicos envolvendo múltiplas biomoléculas.

Sob a liderança do químico da LMU, Professor Philip Tinnefeld, e em cooperação com o Professor Fernando Stefani (Buenos Aires), os pesquisadores da LMU desenvolveram agora a multiplexação pMINFLUX, uma abordagem elegante para resolver este problema.

A equipe publicou um artigo sobre seu método na revista Nature Photonics .

MINFLUX é um método de microscopia de super-resolução, permitindo localizações com precisão de apenas um nanômetro. Em contraste com o MINFLUX convencional, o pMINFLUX registra a diferença de tempo entre a excitação dos corantes com um pulso de laser e a subsequente fluorescência com resolução subnanosegundo.

Além de localizar os corantes, isso fornece informações sobre outra propriedade fundamental de sua fluorescência:seu tempo de vida de fluorescência. Isso descreve quanto tempo, em média, leva para uma molécula de corante ficar fluorescente depois de ser excitada.

“O tempo de vida da fluorescência depende do corante utilizado”, explica Fiona Cole, co-autora da publicação. "Exploramos as diferenças nos tempos de vida da fluorescência ao usar corantes diferentes para atribuir os fótons fluorescentes ao corante emitido sem a necessidade de piscar e a separação temporal resultante."

Para tanto, os pesquisadores adaptaram o algoritmo de localização e incluíram um modelo de ajuste multiexponencial para atingir a separação necessária.

“Isso nos permitiu determinar a posição de vários corantes simultaneamente e investigar processos dinâmicos rápidos entre múltiplas moléculas com precisão nanométrica”, acrescenta Jonas Zähringer, também co-primeiro autor.

Os pesquisadores demonstraram seu método rastreando com precisão duas cadeias de DNA enquanto elas saltavam entre diferentes posições em uma nanoestrutura de origami de DNA, bem como separando os movimentos translacionais e rotacionais de uma nanoestrutura de origami de DNA e medindo a distância entre os locais de ligação ao antígeno dos anticorpos.

“Mas isto é apenas o começo”, diz Philip Tinnefeld. "Estou certo de que a multiplexação pMINFLUX, com sua alta resolução temporal e espacial, fornecerá novos insights sobre as interações proteicas e outros fenômenos biológicos no futuro."

Mais informações: Fiona Cole et al, FRET super-resolvido e co-rastreamento em pMINFLUX, Nature Photonics (2024). DOI:10.1038/s41566-024-01384-4
Informações do diário: Fotônica da Natureza

Fornecido pela Universidade Ludwig Maximilian de Munique