Os pesquisadores frequentemente estudam biomoléculas como proteínas ou aminoácidos anexando quimicamente um "fluoroforo", uma molécula sensível que absorve e reemite energia da luz.



Quando ativados por um laser e fotografados através de um microscópio de alta potência, essas etiquetas ou rótulos fluoróforos explodem em um arco-íris de cores e informações. Eles fornecem uma riqueza de informações que podem, por exemplo, ajudar a detectar doenças ou identificar condições genéticas.

Para detectar mais de um tipo de molécula por vez, ou medições "multiplex", são usados ​​tipos adicionais de fluoróforos que emitem diferentes cores de luz. Mas é surpreendentemente difícil distinguir cores diferentes no nível de uma única molécula. É por isso que a maioria dos microscópios observa apenas três a quatro cores.

Os pesquisadores podem quebrar essa barreira de cores usando técnicas avançadas que envolvem rodadas de rotulagem e geração de imagens que duram dias ou empregam configurações complicadas com muitos lasers. Encontrar uma maneira simples e rápida de ver muitas cores, entretanto, continua sendo um grande desafio.

Pesquisadores da Escola Pritzker de Engenharia Molecular da UChicago têm uma nova solução para esse desafio, descrita em um artigo publicado hoje na Nature Nanotechnology . Uma nova técnica delineada pelo Squires Lab usa três blocos de construção químicos simples para projetar dezenas de tags "FRETfluor", criando um espectro de cores mais bonito e matizado que os pesquisadores podem usar para rotular biomoléculas.

"Nossa abordagem é mais fácil. É uma dose de rotulagem, uma dose de imagem", disse o co-primeiro autor Jiachong Chu, Ph.D. em Engenharia Molecular da UChicago Pritzker. candidato. "Isso significa que você pode fazer mais com menos. Atualmente, nossa nova técnica é a melhor na área."

Um novo caminho para a multiplexação

As moléculas individuais são pequenas e as amostras de células são comparativamente enormes, complicadas e confusas. O objetivo final desta área de pesquisa – que o artigo da equipe do PME coloca mais perto do que nunca – é a multiplexação.

"Multiplexar amostras significa ser capaz de, na mesma medição, medir mais de uma espécie de molécula, então talvez você tenha 10 ou 50, ou centenas de proteínas diferentes que deseja identificar", disse o professor assistente de engenharia molecular da família Neubauer, Allison. Escudeiros. "Com esta nova técnica, podemos fazer dezenas. Acredito que podemos estender isso para centenas."

Para enfrentar este desafio, a equipe do Squires Lab encontrou uma maneira inovadora de usar uma técnica bem estabelecida:Transferência de Energia de Ressonância Förster ou FRET. FRET é um mecanismo que descreve como a energia é transferida entre moléculas sensíveis à luz. É uma forma de os pesquisadores medirem a distância entre diferentes partes de uma molécula ou relatarem quando duas moléculas interagem. Os sinais FRET são excepcionalmente sensíveis às propriedades dos fluoróforos participantes, que a equipe da UChicago usou para ajustar seus rótulos FRETfluor.

"Este projeto utiliza o FRET de uma nova maneira", disse a coautora Ayesha Ejaz, Ph.D. candidato em Química. "FRET é comumente usado para medir distâncias e observar dinâmica em biomoléculas. Mudamos o espaçamento entre um corante doador e aceitador para criar diferentes eficiências de FRET e outras propriedades que usamos para identificar as diferentes construções."

As 27 etiquetas utilizadas na pesquisa da equipe do PME foram 27 “FRETfluors” que eles desenvolveram usando uma combinação simples de DNA, um corante de cianina verde (Cy3) e um corante de cianina vermelho (Cy5). Além de brilhar em cores diferentes, cada um dos FRETfluors exibe outras propriedades ajustáveis, como o tempo de emissão dos fótons ou quais são as orientações desses fótons.

Juntas, essas propriedades podem ser usadas para identificar um FRETfluor em apenas uma fração de segundo, em concentrações ultrabaixas. Ejaz disse que uma possível direção futura para esta pesquisa é eventualmente substituir os marcadores fluoróforos comuns por esses FRETfluors.

"Normalmente, quando as pessoas desejam observar várias coisas - como diferentes partes de uma célula - ao mesmo tempo, elas rotulam cada componente com uma etiqueta fluorescente diferente que emite uma determinada cor de luz. Mas as etiquetas fluorescentes são limitadas a quatro ou cinco cores ", disse Ejaz.

"Se o FRETfluors puder ser usado, poderemos aumentar o número de 'cores' disponíveis para microscopia de fluorescência. Atualmente, estamos testando o quão bem os FRETfluors funcionam em diferentes tipos de experimentos e ambientes, o que nos dará uma melhor compreensão de todos as possibilidades."

“Estou animada para ver o FRETfluors em ação”, disse ela.

Sensibilidade e simplicidade

Para Squires, grande parte do apelo da nova técnica de multiplexação vem da sensibilidade combinada com a simplicidade.

“Todo mundo quer multiplexar seu ensaio favorito e existem muitas estratégias que funcionarão em determinadas situações”, disse ela. “Existem técnicas que funcionam bem quando você tem muito tempo ou quando sua amostra está morta e nada se move.

“Estamos atacando o problema onde você não tem muito tempo. Você quer saber que doença alguém tem enquanto ainda há tempo para combatê-la, ou você tem apenas uma pequena amostra e tem uma chance para identificar cada molécula à medida que flui através do seu canal, podemos identificar FRETfluors em uma fração de segundo, até dezenas de concentrações femtomolares."

A simplicidade é fundamental, tanto pelo uso de produtos químicos comuns para fazer os FRETfluors quanto pelo pioneirismo em uma técnica que precisa apenas de um laser para leitura.

“Nós marcamos o alvo apenas uma vez e fazemos a leitura apenas uma vez”, disse Chu. “Nesse contexto, podemos criar 27 tags diferentes que podem ser usadas ao mesmo tempo”.

Squires descreveu como as técnicas existentes poderiam ser usadas junto com FRETfluors para obter mais ganhos de multiplexação - "você poderia introduzir esquemas sofisticados de excitação de laser ou incorporar outros fluoróforos que tenham propriedades ligeiramente diferentes" - que melhorariam as leituras dos rótulos existentes.

Aplicar esses multiplicadores à sua técnica nova e mais poderosa, disse Squires, pode abrir mundos de novas pesquisas e aplicações.

“Essas melhorias em imagens e ensaios biomédicos baseados em fluxo permitirão a próxima geração de inovação”, disse Squires.

Mais informações: Jiachong Chu et al, Multiplexação de fluorescência de molécula única por detecção espectroscópica multiparâmetro de rótulos FRET nanoestruturados, Nature Nanotechnology (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01672-8
Informações do diário: Nanotecnologia da Natureza

Fornecido pela Universidade de Chicago