p Uma equipe de nanobiotecnologistas do Instituto Wyss de Engenharia Inspirada na Biologia de Harvard e do Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) liderada por William Shih, membro do corpo docente fundador do Wyss, Ph.D., desenvolveu uma estratégia de automontagem de DNA programável que resolve o principal desafio do controle de nucleação robusto e abre caminho para aplicações como detecção ultrassensível de biomarcadores diagnósticos e fabricação escalável de estruturas micrométricas com recursos nanométricos. p Usando o método, chamada de "polimerização cruzada", os pesquisadores podem iniciar a tecelagem de nanofitas a partir de fitas simples alongadas de DNA (conhecidas como "lâminas") por um evento de nucleação estritamente dependente da semente. O estudo é publicado em Nature Communications .

p As nanoestruturas de DNA têm grande potencial para resolver vários diagnósticos, terapêutico, e desafios de fabricação devido à sua alta biocompatibilidade e programação. Para funcionar com dispositivos de diagnóstico eficazes, por exemplo, uma nanoestrutura de DNA pode precisar responder especificamente à presença de uma molécula alvo, desencadeando uma leitura amplificada compatível com instrumentos de baixo custo acessíveis em pontos de atendimento ou configurações de laboratório clínico.

p A maioria das nanoestruturas de DNA são montadas usando uma das duas estratégias principais, cada uma com seus pontos fortes e limitações. O "origami de DNA" é formado a partir de uma longa fita de suporte de fita simples que é estabilizada em uma configuração bidimensional ou tridimensional por numerosas fitas de suporte mais curtas. Sua montagem é estritamente dependente da vertente do andaime, levando a um dobramento robusto do tipo tudo ou nada. Embora possam ser formados com alta pureza em uma ampla gama de condições, seu tamanho máximo é limitado. Os "tijolos de DNA", por outro lado, podem montar estruturas muito maiores a partir de uma infinidade de curtos filamentos modulares. Contudo, sua montagem requer condições ambientais rigidamente controladas, pode ser iniciado espúrio na ausência de uma semente, e produz uma proporção significativa de estruturas incompletas que precisam ser removidas.

p "A introdução do origami de DNA foi o avanço de maior impacto no campo da nanotecnologia de DNA nas últimas duas décadas. A abordagem de polimerização cruzada que desenvolvemos neste estudo constrói esta e outras bases para estender a automontagem controlada de DNA em muito escalas de comprimento maiores, "disse Shih, que co-lidera a Iniciativa de Robótica Molecular de Wyss, e também é professor na Harvard Medical School e DFCI. "Prevemos que a polimerização cruzada possibilitará amplamente a formação do tipo tudo ou nada de microestruturas bidimensionais e tridimensionais com recursos em nanoescala endereçáveis, automontagem algorítmica, e amplificação de sinal de fundo zero em aplicações de diagnóstico que requerem extrema sensibilidade. "

p Plantando uma semente

p Tendo experimentado as limitações de origami de DNA e nanoestruturas de tijolo de DNA, a equipe começou perguntando se era possível combinar a dependência absoluta da semente da montagem do origami de DNA com o tamanho ilimitado das construções de tijolos de DNA em um terceiro tipo de nanoestrutura de DNA que cresce rápida e consistentemente até um tamanho grande.

p "Argumentamos que a montagem tudo ou nada de estruturas de DNA em escala mícron poderia ser alcançada projetando um sistema que tenha uma barreira de alta energia livre para a montagem espontânea. A barreira só pode ser contornada com uma semente que liga e organiza um conjunto de lâminas de 'nucleação' para captura conjunta de lâminas de 'crescimento'. Isso inicia uma reação em cadeia de adições de ripas de crescimento que resulta em fitas de DNA longas, "disse o co-primeiro autor Dionis Minev, Ph.D., que é pós-doutorado na equipe de Shih.

p "Este tipo de altamente cooperativo, a nucleação estritamente dependente da semente segue alguns dos mesmos princípios que regem a iniciação e o crescimento das células do citoesqueleto ou do filamento do microtúbulo. por sua vez, é necessário para a ligação do próximo. "A polimerização cruzada leva essa estratégia para o próximo nível, permitindo que vizinhos não mais próximos sejam necessários para o recrutamento de monômeros de entrada. O nível extremo de coordenação resultante é o molho secreto, "disse Minev.

p Do conceito à (s) estrutura (s) real (is)

p Colocando seu conceito em prática, a equipe projetou e validou um sistema no qual uma minúscula estrutura de semente oferece uma alta concentração inicial de sítios de ligação pré-formados na forma de filamentos de DNA protuberantes. Estes podem ser detectados por lâminas de DNA com seis (ou em um sistema cruzado alternativo oito) locais de ligação disponíveis, cada ligação a uma das seis (ou oito) fitas de ssDNA salientes vizinhas em um padrão cruzado, e as subsequentes ripas de DNA são então continuamente adicionadas à estrutura de alongamento.

p "Nosso design é notável porque alcançamos um rápido crescimento de enormes estruturas de DNA, ainda com controle de nucleação que é ordens de magnitude maior do que outras abordagens. É como ter seu bolo e comê-lo também, porque criamos montagens em grande escala e o fazíamos apenas onde e quando desejávamos, "disse o co-primeiro autor Chris Wintersinger, um Ph.D. aluno do grupo de Shih que colaborou no projeto com Minev. "O controle que alcançamos com o cruzado excede em muito o observado para os métodos de DNA existentes, onde a nucleação só pode ser direcionada dentro de uma janela estreita de condições onde o crescimento é excessivamente lento."

p Usando polimerização cruzada, A equipe de Shih gerou fitas de DNA que se auto-montaram como resultado de um único evento de semeadura específico em estruturas que mediam até dezenas de micrômetros de comprimento, com uma massa quase cem vezes maior do que um origami de DNA típico. Além disso, aproveitando a alta programabilidade das conformações e interações das ripas, os pesquisadores criaram fitas com voltas e torções distintas, resultando em estruturas em espiral e em tubo.

p Em estudos futuros, isso poderia ser aproveitado para criar estruturas funcionalizadas que podem se beneficiar de compartimentos separados espacialmente. "Uma aplicação imediata para o nosso método de nanoconstrução cruzada é como uma estratégia de amplificação em ensaios de diagnóstico após a formação de nanoseeds a partir de biomarcadores específicos e raros, "disse a co-autora Anastasia Ershova, que também é um Ph.D. aluno orientado por Shih.

p "O desenvolvimento deste novo método de nanofabricação é um exemplo notável de como a Molecular Robotics Initiative do Wyss Institute continua a ser inspirada por sistemas biológicos, nesse caso, crescimento de filamentos do citoesqueleto, e continua expandindo as possibilidades neste campo emocionante. Este avanço traz o potencial da nanotecnologia de DNA para mais perto de resolver desafios diagnósticos urgentes para os quais atualmente não há soluções. "disse o Diretor Fundador da Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., que também é o professor Judah Folkman de Biologia Vascular na Harvard Medical School e no Boston Children's Hospital, e Professor de Bioengenharia na Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas de Harvard John A. Paulson.