Às 2h da madrugada de abril passado, Michael Schoof verificou três vezes os números em sua tela, respirou fundo, e disparou um e-mail que esperou o dia todo para enviar.

"Acho que está funcionando" foi a formulação cautelosa de sua mensagem.

Schoof, um estudante de graduação no laboratório de Peter Walter, Ph.D., um renomado cientista especializado em classificação de proteínas e membranas celulares, fazia parte de uma pequena equipe em uma missão quixotesca:imobilizar o SARS-CoV-2, o novo coronavírus que causa COVID, usando uma versão sintética de minúsculos anticorpos originalmente descobertos em lhamas e camelos. Esses "nanocorpos, "como são conhecidos, tinha vindo do laboratório da UC San Francisco de Aashish Manglik, M.D., Ph.D., um promissor cientista de proteínas que passou os três anos anteriores construindo uma vasta biblioteca de nanocorpos e desenvolvendo novas maneiras de explorar suas propriedades incomuns.

Durante o mês anterior, Schoof havia passado a maior parte de suas horas de vigília enclausurado no complexo de laboratório vazio no campus de Mission Bay da UCSF. Foi o auge do pico da primavera de 2020 do COVID, e apenas pessoal de saúde essencial e aqueles que trabalham com ciência relacionada à pandemia tiveram permissão para entrar nas instalações da Universidade. Schoof havia arrastado seu colega de quarto, um colega estudante de graduação chamado Reuben Saunders, para trabalhar com ele no projeto. Subsistindo com bolinhos cozidos no vapor e litros de chá, eles examinaram os 2 bilhões de nanocorpos na biblioteca de Manglik na esperança de identificar uma molécula capaz de se aglutinar no mortal SARS-CoV-2 e imobilizá-lo. Agora, finalmente, Schoof estava convencido de que haviam alcançado seu primeiro grande avanço.

O primeiro passo em qualquer infecção viral é o sequestro celular. Para obter o controle de uma célula humana, O SARS-CoV-2 prende as pontas em forma de gancho em seu próprio exterior às proteínas chamadas receptores ACE2 no exterior de uma célula-alvo. Mas e se, os pesquisadores se perguntaram, eles poderiam bloquear o sequestrador dando aos ganchos outra coisa para se agarrar?

Aquele dia, Schoof começou a fazer testes em centenas de colônias de levedura, cada um projetado para produzir certos nanocorpos da biblioteca de Manglik. Todos esses nanocorpos em particular demonstraram uma capacidade de se prender aos picos do SARS-CoV-2. Agora era hora de fazer as perguntas-chave:com que força esses nanocorpos estavam ligados aos espinhos? Eles foram capazes de competir com os receptores ACE2?

Descobrir, Schoof tinha misturado suas células de levedura que expressam nanocorpos com spikes fluorescentes SARS-CoV-2. Quando ele olhou para os resultados das duas primeiras placas, ele sentiu uma onda de excitação, que ele rapidamente temperou com o ceticismo científico que aprendera a cultivar. Alguns dos nanocorpos estavam aderindo aos picos de SARS-CoV-2, mas ainda podiam ser empurrados para o lado por um excesso de receptores ACE2 humanos:evidência clara de um neutralizador em potencial.

"Este, "ele lembra, "é quando sabíamos que tínhamos algo."

Nos dias que se seguiram ao circunspecto e-mail noturno de Schoof, Walter e Manglik exploraram suas respectivas redes de contatos científicos, chamando reforços de laboratórios em todo o campus e em lugares distantes como Paris para ajudar na próxima fase de sua busca. Breve, a pequena equipe havia se transformado em um verdadeiro exército de pesquisadores interdisciplinares e estudantes de pós-graduação. Em novembro, eles publicaram seus resultados na prestigiosa revista Science. No papel, quase 60 co-autores descreveram um negrito, contramedida COVID inovadora, propondo que seus nanocorpos poderiam ser usados ​​de uma forma barata, spray nasal fácil de transportar, capaz de neutralizar a SARS-CoV-2. Entre eles, eles apelidaram as moléculas de AeroNabs.

Desde então, a equipe UCSF tem procurado um parceiro da indústria disposto a financiar o processo de ensaio clínico caro e rigoroso, mas atualmente as empresas farmacêuticas estão focadas no desenvolvimento de vacinas para prevenção e anticorpos mais tradicionais para tratamento.

Mas a abordagem dos nanocorpos é promissora. Devido à estrutura simples dos nanocorpos, AeroNabs poderia ser muito mais barato e rápido de produzir em massa, muito mais fácil de transportar, e muito mais fácil de armazenar do que os anticorpos tradicionais atualmente em uso e em desenvolvimento.

"Isso é algo que você pode tomar após o teste positivo que pode diminuir sua carga viral imediatamente, "Walter diz." Então, suas chances de desenvolver doenças graves seriam reduzidas com este tratamento. "

Ele também observa que a vacinação em massa levará tempo, e que nem todos na população podem ou serão vacinados, tornando a proteção passiva ainda incrivelmente valiosa. "E, " ele adiciona, "não sabemos quão amplamente a vacina estará disponível além dos países mais ricos do mundo."

Dupla dinamica

As sementes do projeto AeroNabs foram plantadas em 2017, quando Walter ouviu Manglik falar sobre seu trabalho.

À primeira vista, os dois cientistas parecem ser um casal estranho. Com sua cabeça cheia de cabelos escuros, sorriso infantil, e queixo bem barbeado, Manglik pode ser confundido com um estudante de pós-graduação. Na verdade, ele é uma estrela em ascensão em seu campo que em 2013 fez Americano científico da lista "30 com menos de 30". Nasceu na Índia, Manglik passou seus primeiros oito anos na Arábia Saudita antes de sua família imigrar para Des Moines, Iowa, onde ele descobriu a ciência na faculdade. O Walter de 60 e poucos anos, por outro lado, ostenta barba e bigode brancos e óculos de lentes pequenas. Ele nasceu e cresceu na Alemanha, veio para os EUA para seu trabalho de graduação, e traçou uma carreira lendária. Suas muitas homenagens incluem o prestigioso Prêmio Lasker, frequentemente visto como o precursor de um Prêmio Nobel. Mas apesar de suas diferenças, Walter e Manglik compartilham uma paixão profunda pela biologia molecular e seus blocos de construção orgânicos infinitamente flexíveis:as proteínas.

A palestra de Manglik naquele dia foi sobre seu esforço para montar uma das maiores bibliotecas de nanocorpos do mundo - um promissor, tipo relativamente novo de anticorpo derivado do sangue de lamas, camelos, e outros animais da família dos camelídeos. Ele havia aprendido sobre nanocorpos na escola de pós-graduação em Stanford, depois de se apaixonar pelo estudo dos receptores, uma ampla família de proteínas envolvidas na sinalização intercelular. Receptores saem das células como antenas, cada um respondendo a um sinal químico específico. Enquanto estudava os receptores de adrenalina humanos, Manglik fez uso extensivo de nanocorpos, que, graças ao seu tamanho minúsculo, pode interagir com os receptores com muito mais precisão do que os anticorpos feitos sob medida que ele estava usando para explorar as propriedades dos receptores. Seus experimentos revelaram como diferentes configurações geométricas de receptores influenciam seu comportamento de sinalização.

"As proteínas não são apenas Legos simples que se encaixam - são como Legos feitos de gelatina ou massa, "Manglik explica." Eles estão em constante movimento. Na verdade, é o movimento de uma proteína, acontece que, isso realmente importa para o modo como funciona. E os nanocorpos podem nos ajudar a controlar esse movimento. "

Nanocorpos:uma bênção para a ciência

Os nanocorpos foram descobertos no final dos anos 1980 por dois alunos de graduação da Universidade Livre de Bruxelas, depois que eles se aproximaram do famoso professor de biologia, um imunologista chamado Raymond Hamers, para reclamar de uma tarefa. A história obscureceu o motivo de sua reclamação; um relato amplamente citado afirma que os alunos estavam preocupados que a tarefa, que exigia que analisassem os anticorpos no sangue humano, pode infectá-los com uma doença. Outra versão afirma que os alunos acharam o experimento enfadonho e pediram ao professor que lhes atribuísse algo mais original.

Seja qual for a verdade, ninguém contesta o que aconteceu a seguir. Remexendo em uma geladeira de laboratório, Hamers encontrou um frasco de soro congelado de camelo dromedário infectado com parasitas que provavelmente causam a doença do sono africana. Ele o deu aos alunos e sugeriu que isolassem os anticorpos no sangue do camelo para ver como eram. Quando os alunos purificaram o sangue, eles descobriram algo incrível.

Além dos anticorpos padrão encontrados em todos os vertebrados, as amostras purificadas continham um anticorpo derivado nunca antes visto na ciência - menor, proteínas mais simples, que os alunos inicialmente confundiram com fragmentos de anticorpos convencionais. Um exame mais aprofundado revelou que eles são uma classe inteiramente nova de agentes imunológicos, faltando uma das cadeias de proteínas encontradas em todos os outros anticorpos previamente estudados.

A descoberta levou a um artigo inovador de 1993 na prestigiosa revista Natureza . Hamers e seus alunos apelidaram os novos nanocorpos de proteínas diminutas. Anticorpos de cadeia única semelhantes foram identificados posteriormente em lamas, alpacas, guanacos (outro mamífero sul-americano de pescoço longo), e até tubarões.

Logo ficou claro que não apenas os nanocorpos eram úteis imunologicamente, mas que seu pequeno tamanho os tornava ferramentas experimentais úteis - como Manglik e seus colegas da UCSF podem amplamente confirmar.

Estudando como esses blocos de construção gelatinosos de nível molecular se movem, encaixe e desaperte, e interagir se tornou o foco de Manglik quando ele se juntou ao corpo docente da UCSF. Ele sabia desde o início que os nanocorpos seriam uma grande parte de seu trabalho. Embora existam anticorpos e nanocorpos para ajudar os animais a combater a infecção, Manglik também os vê como uma ferramenta infinitamente maleável que pode ser usada para invadir uma ampla gama de processos no corpo humano, bem como decodificar mistérios científicos básicos. Mas os nanocorpos eram demorados para fazer e exigiam acesso aos camelídeos. Como estudante de graduação, Manglik tinha contado com um colaborador na Bélgica que injetaria uma proteína receptora de interesse em uma lhama, em seguida, colete os nanocorpos do sangue do animal. Todo o processo levou meses de trabalho muito especializado, que apenas alguns grupos tinham a capacidade de fazer.

Para democratizar o acesso a nanocorpos para pesquisadores em todos os lugares, Manglik se juntou a Andrew Kruse, Ph.D., um amigo próximo da pós-graduação que ingressou no corpo docente da Harvard Medical School. Juntos, os dois laboratórios criaram trilhões de sequências de DNA que codificam nanocorpos, cada um deles inspirado nos nanocorpos normalmente encontrados dentro das lhamas. As sequências de DNA para esses nanocorpos estão alojadas em um vasto pool de bilhões de células de levedura diminutas, cada um dos quais pode ser persuadido a colocar uma cópia de um nanocorpo individual em sua superfície. Ignorando completamente a necessidade de uma lhama viva, essa biblioteca dá aos pesquisadores acesso a células de levedura que abrigam nanocorpos específicos para qualquer tarefa. Manglik e Kruse compartilharam abertamente suas bibliotecas com centenas de laboratórios em todo o mundo.

"A ideia é que em um animal, existem trilhões de nanocorpos diferentes para lutar contra qualquer coisa que possa encontrar, "ele diz." Queríamos fazer uma biblioteca que codificasse bilhões de nanocorpos individuais. Esta biblioteca seria um ótimo ponto de partida para encontrar um nanocorpo contra basicamente qualquer coisa - tudo no laboratório e sem a necessidade de injetar um animal. "

Depois de ouvir Manglik explicar tudo isso, Walter conduziu seu aluno de graduação Michael Schoof ao laboratório de Manglik. Schoof estava tentando modular o comportamento de uma proteína relacionada a lesão cerebral traumática, e Walter suspeitou que os nanocorpos de Manglik poderiam ser úteis nesse esforço.

Em seguida, o coronavírus atingiu, o mundo parou, e quase todas as atividades não relacionadas ao COVID na Universidade foram encerradas.

"Então, nesse ponto, nós dissemos, "Nós vamos, podemos sentar em casa agora, ou podemos pensar em como podemos realmente ajudar nessa busca por uma solução, '", Lembra Walter.

Dentro de alguns dias, Walter e Schoof estavam em contato por e-mail com Manglik. Eles conheciam as propriedades de combate a doenças dos nanocorpos. Uma tecnologia de nanocorpo ganhou recentemente a aprovação do FDA para tratar um distúrbio de coagulação do sangue, e um outro, usado para tratar um vírus respiratório, tinha chegado a ensaios clínicos em estágio avançado.

Seria possível que eles pudessem construir um para lutar contra o coronavírus?

Um resultado incrível

Do começo, a equipe sabia, o sucesso do projeto dependeria de sua capacidade de encontrar um nanocorpo com afinidade de ligação suficiente - a capacidade de prender e usar uma camisa-de-força nas pontas do coronavírus.

As proteínas têm formas específicas. O quão bem duas proteínas se encaixam determina sua afinidade de ligação. Walter e Manglik sabiam que a afinidade de ligação que faz com que o SARS-CoV-2 adira às proteínas ACE2 poderia teoricamente ser superada por um nanocorpo moldado da maneira certa.

Manglik já tinha um ingrediente chave para tal experimento. Pesquisadores da Universidade do Texas (UT) em Austin revelaram recentemente a estrutura única dos picos do SARS-CoV-2, que permitem que o vírus se ligue aos receptores ACE2 das células humanas. Manglik estendeu a mão para Jason McLellan da UT, Ph.D., que concordou em enviar a ele sua "construção" - um pedaço de código de DNA para as pontas que poderiam ser inseridas em outra célula, expresso em grandes quantidades, purificado, e usado para experimentos.

A equipe começou a examinar os 2 bilhões de nanocorpos na biblioteca para ver se eles poderiam encontrar compostos com a afinidade de ligação certa para os picos de SARS-CoV-2. Dentro de três semanas, eles identificaram 800 candidatos potenciais, e uma semana depois, Schoof escreveu seu cauteloso e-mail noturno informando Manglik e Walter que havia visto alguns resultados positivos iniciais. No final de abril, a equipe identificou 21 nanocorpos distintos que pareciam competir com o receptor ACE2, teoricamente bloqueando o mecanismo de fixação do SARS-CoV-2.

Foi quando a pequena equipe começou a aumentar, recrutando biólogos estruturais para determinar como os nanocorpos se ligaram à proteína spike SARS-CoV-2, e, em seguida, usar essas informações para projetar modificações para torná-las ainda mais poderosas.

Isso exigiu a purificação de 21 proteínas candidatas, testando sua ligação, e, em seguida, usando as instalações de microscopia crioeletrônica da UCSF para obter imagens em resolução quase atômica dos candidatos mais promissores, enquanto eles estavam ligados ao pico SARS-CoV-2. Para completar esta tarefa monumental, eles uniram forças com um esforço paralelo conhecido como QCRG Structural Biology Consortium - um processo semelhante a uma linha de montagem reunido por 12 membros do corpo docente da UCSF e mais de 60 trainees para lidar com a SARS-CoV-2. O esforço foi alimentado por um senso de urgência, e os participantes trabalharam horas extenuantes até tarde da noite.

Assim que a equipe obteve imagens dos principais nanocorpos ligados ao pico SARS-CoV-2, eles começaram a examinar o mecanismo de ligação exclusivo de cada nanocorpo e usaram essa informação para projetar uma versão de próxima geração. Eles decidiram construir um nanocorpo de três braços consistindo de três cópias de um único nanocorpo costurado para que pudesse se ligar simultaneamente aos três braços separados que compõem cada pico do coronavírus.

Depois de costurar os nanocorpos e testá-los, Bryan Faust, um estudante de graduação no laboratório de Manglik, entregou a próxima descoberta empolgante:cada um dos três braços aumentava a ligação de seus vizinhos exponencialmente. A capacidade da versão aprimorada de se ligar aos picos virais aumentou duzentas mil vezes.

"Este foi um resultado incrível - ver essa enorme ordem de melhoria, "Walter lembra." Era um momento de celebração absoluta. "

Para testar o composto contra um vírus vivo, a equipe precisava de um laboratório com designação de Nível de Biossegurança 3 (BSL-3). O grupo recrutou Marco Vignuzzi, Ph.D., um ex-pós-doutorado da UCSF que dirige um laboratório BSL-3 no Institut Pasteur em Paris. Em junho, um dos pós-docs de Vignuzzi estava executando o nanocorpo UCSF contra o SARS-CoV-2 real para ver se ele era capaz de neutralizar o vírus.

O resultado final foi altamente eficaz e estável - tão estável que pode ser fornecido na forma de aerossol usando um nebulizador de malha que Manglik comprou na Amazon.

Com o laser da Big Pharma focado no desenvolvimento de vacinas e anticorpos tradicionais, Encontrar um caminho rápido para a comercialização revelou-se um desafio. Mas Manglik, Walter, e sua equipe não se intimidou.

"É quase certo que haverá mais pandemias respiratórias em nossa vida, "diz Manglik." Pode ser gripe, outra pandemia de SARS, ou algum patógeno que ainda não conhecemos. Para a próxima pandemia, a esperança é que os pesquisadores possam ir não apenas tão rápido quanto nós, mas talvez ainda mais rápido. "

Sem duvida, seria difícil encontrar um testamento mais potente da deliciosa imprevisibilidade e potencial da ciência moderna - que uma pandemia que causou solidão, Sofrimento, e a morte também deu origem a essa tripulação eclética e sua solução potencialmente salva-vidas que apenas alguns anos atrás poderia ter parecido absurda.

"É apenas uma daquelas coisas em que você diz, “Queremos partir nesta aventura, '", Diz Walter." Nós nos comprometemos com isso, e então funcionou muito melhor do que poderíamos ter sonhado. "