p Atualmente é um desafio observar diretamente a formação de nanoestruturas intracelulares em laboratório. Em um novo relatório, Miaomiao Zhang e uma equipe de pesquisa em química, Ciências da Vida, engenharia médica e ciência e tecnologia, na China, usaram uma pequena molécula racionalmente projetada abreviada NBC-Iod-CBT (abreviação de 4-nitrobenzil carbamato-Cys (SEt) -Asp-Asp-Phe (iodo) -2-ciano-benzotiazol) e a formação de nanopartículas intracelulares diretamente observada com tomografia nanocomputada ( nano-CT). p Durante os experimentos, os mecanismos de redução da glutationa (GSH) e clivagem da nitro-redutase (NTR) fizeram com que as moléculas NBC-Iod-CBT passassem por uma reação de condensação de clique e nanopartículas de automontagem (NPs) como Iod-CBT-NPs. Quando a equipe realizou imagens de nano-TC de NBC-Iod-CBT tratado, células HeLa que expressam nitroredutase no laboratório, eles mostraram a existência de Iod-CBT-NPs auto-organizados em seu citoplasma. A nova estratégia agora está publicada em Avanços da Ciência e ajudará cientistas da vida e bioengenheiros a entender os mecanismos de formação de nanoestruturas intracelulares.

p Uma estratégia inteligente para nanomontagem

p Montar nanoestruturas usando pequenos precursores moleculares dentro das células é uma estratégia inteligente com grandes vantagens em imagens moleculares e distribuição de drogas. Pequenas moléculas podem ser absorvidas facilmente pelas células, mas eles também são eliminados rapidamente. Em contraste, nanoestruturas com agentes terapêuticos têm períodos de retenção mais longos em células com maior potência. No entanto, é muito mais difícil para uma célula assumir uma nanoestrutura em comparação com uma molécula pequena. Os cientistas, portanto, ativam nanoestruturas para absorção celular, modificando a superfície da célula com ogivas de alvejamento, 'mas tais modificações podem diminuir a reprodutibilidade do nanocomplexo. Como resultado, um método inteligente desenvolvido recentemente visa formar nanopartículas intracelulares, onde as culturas de células incubadas com um pequeno precursor molecular terão uma nanoestrutura neles, para aplicações interessantes em imagem molecular e entrega de drogas. Contudo, ainda é difícil diferenciar entre as nanoestruturas formadas artificialmente de estruturas celulares intrínsecas. Para conseguir isso, Zhang et al. projetou primeiro um precursor de molécula pequena contendo iodo (iodo), eles então submeteram o composto à auto-montagem intracelular instruída por enzimas para formar as nanopartículas de interesse e usaram nano-CT (tomografia nanocomputada) para observar as nanopartículas intracelulares.

p O experimento

p A pequena estrutura molecular iodada NBC-Iod-CBT tinha um design racional constituído por quatro partes, que incluiu

1. Um substrato de 4-nitrobenxil carbamato (NBC) para quebrar a nitroredutase (NTR),
2. Um motivo de cisteína (Cys) latente e estruturas de 2-ciano-benzotiazol (CBT) para reações de condensação de clique de CBT-Cys,
3. Uma região iodada para realce de contraste de tomografia computadorizada, e
4. Dois motivos de ácido aspártico hidrofílico para boa solubilidade em água sob condições fisiológicas

s.

p Quando o composto entrou em células cancerosas hipóxicas (desprovidas de níveis adequados de oxigênio) com superexpressão de nitroredutase (NTR), eles passaram por automontagem para formar nanopartículas (NPs) conhecidas como Iod-CBT-NPs. Para induzir a formação de nanopartículas desencadeada por nitroredutase (NTR) no laboratório, os cientistas incubaram a pequena molécula NBC-Iod-CBT com soluções salinas tamponadas e adicionaram a solução de nitroredutase por duas horas para formar nanoestruturas com absorbâncias visíveis entre 500-700 nm.

p Quando Zhang et al. adicionado um inibidor de nitroredutase conhecido como dicumarina à solução, as absorbâncias visíveis das misturas diminuíram, confirmando a formação de nanoestruturas na presença de nitroredutase. Usando imagens de microscopia eletrônica de transmissão, a equipe observou o aparecimento de nanopartículas e usou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa de ionização / dessorção a laser assistida por matriz de alta resolução para confirmar a formação de Iod-CBT-NPs. Zhang et al. depois disso, usou imagens de nano-CT tridimensionais (3-D) da mistura com uma nano-CT de microscopia de raios-X suave para reconstruir finalmente as imagens de nano-CT 3-D, onde diferentes constituintes do composto exibiram diferentes capacidades de absorção de raios-X. Desta maneira, o experimento facilitou que o composto de interesse NBC-Iod-CBT se submetesse à automontagem desencadeada por NTR para formar as nanopartículas esperadas (Iod-CBT-NPs) no laboratório.

p Formação intracelular de Iod-CBT-NPs e imagem de nano-TC de microscopia de raios-X suave

p Zhang et al. em seguida investigou o mesmo processo experimental para induzir a automontagem de nanopartículas dentro das células. O composto de interesse (NBC-Iod-CBT) teve maior seletividade em relação à nitroredutase, para assim evitar quaisquer possíveis interferências intracelulares na presença de outros constituintes intracelulares, como os biotióis, oxidantes e aminoácidos. As células de câncer cervical humano HeLa normalmente superexpressam a nitroredutase (NTR) sob condições de hipóxia (privadas de níveis adequados de oxigênio), atingindo níveis experimentais mais altos dentro de oito horas. Quando Zhang et al. células hipóxicas HeLa incubadas com a pequena molécula NBC-Iod-CBT, eles observaram a eventual formação de nanopartículas dentro das células hipóxicas HeLa. Usando imagens de microscopia eletrônica das células, eles mostraram a existência das nanopartículas como esperado no citoplasma da célula.

p Para observar diretamente as nanopartículas de interesse (Iod-CBT-NP) dentro das células, a equipe tratou experimentalmente as células hipóxicas HeLa e as imagens usando microscopia de raio-X suave nano-CT. Eles então usaram células HeLa hipóxicas pré-tratadas com dicoumarina ou normóxia (níveis normais de oxigênio) como dois controles positivos e células HeLa hipóxicas ou normóxia não tratadas como dois controles negativos. Os resultados indicaram a formação de nanopartículas de Iod-CBT no citoplasma de células hipóxicas HeLa. Quando eles submeteram essas células ao tratamento com inibidor de nitroredutase, o contraste da TC do citoplasma diminuiu. A equipe reconstruiu projeções 2-D das células para obter imagens nanoCT 3-D. Usando o coeficiente de absorção linear (LAC) ou coeficiente de atenuação linear, Zhang et al. confirmou a viabilidade da formação de nanopartículas intracelulares.

p Panorama

p Desta maneira, Miaomiao Zhang e seus colegas projetaram racionalmente um construto de pequena molécula iodada NBC-Iod-CBT para formar e observar nanopartículas dentro das células usando nano-CT. Após experimentos de primeira mão conduzidos in vitro, a equipe conduziu estudos adicionais no citoplasma de células HeLa que expressam nitroredutase. Usando técnicas analíticas, a equipe mostrou a formação de nanopartículas (Iod-CBT-NP) nas células hipóxicas HeLa tratadas com pequenas moléculas NBC-Iod-CBT. Eles verificaram seu método usando o coeficiente de absorção linear e confirmaram a viabilidade da formação de nanopartículas intracelulares. Este trabalho ajudará os pesquisadores a obter conhecimentos mais profundos para a formação de nanoestruturas intracelulares com aplicações significativas em nanomedicina e bioengenharia. p © 2020 Science X Network