p "O que estamos fazendo aqui é, na verdade, visualizar a ligação do pico à ACE 2 [enzima conversora de angiotensina 2], "diz Kirill Gorshkov, um cientista pesquisador do National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) em Maryland, NÓS. p Embora isso possa soar inocente para os não iniciados, essa ligação é a primeira etapa de um processo de proliferação viral que pode ter levado à pior pandemia de que há memória. O "pico" é uma proteína do vírus SARS-CoV-2 amplamente reconhecida como a principal arma de ataque para mobilizar seu DNA viral em uma célula hospedeira. Os receptores ACE2 são proteínas de células humanas que efetivamente abrem a porta para esse ataque. Usando pontos quânticos de bioengenharia, Gorshkov e Eunkeu Oh no Naval Research Laboratory (NRL) em Washington, D.C., e seus colegas foram capazes de imaginar a ligação e subsequente internalização que ocorre quando a ACE2 e a proteína spike interagem. "Você pode realmente ver isso acontecer em tempo real, "acrescenta Gorshkov, "Essa é a beleza deste ensaio e é por isso que pensamos que será importante para o rastreio de drogas."

p Um vírus não pode se reproduzir sem registrar uma célula hospedeira, portanto, pesquisadores em todo o mundo têm trabalhado para entender como o SARS-CoV-2 interage e penetra nas células com o objetivo de bloquear esse estágio e prevenir o aparecimento de COVID19. Gorshkov e seus colegas do NCATS já estavam trabalhando em vários ensaios de imagem para câncer, vírus e doenças de armazenamento lisossomal, "mas quando o coronavírus atingiu, nós rapidamente tivemos que mudar de marcha, "diz Gorshkov.

p Pesquisa SARS anterior havia destacado a importância das interações com ACE2 em células humanas para a propagação deste tipo de vírus, e eles já eram capazes de marcar essas proteínas receptoras com uma proteína fluorescente verde para obter imagens de seus movimentos. Evidências também estavam se acumulando para localizar as proteínas de pico específicas no SARS-CoV-2 que podem estar bloqueando a ACE2 em uma fortaleza para que o vírus possa entrar na célula. Contudo, as informações sobre as interações de proteína de pico foram acumuladas principalmente indiretamente de ensaios bioquímicos ou de proximidade e testes com proteínas e partes de proteínas retiradas do vírus - "pseudo-partículas de viro". Sem marcação fluorescente dessas proteínas virais, seu papel na ligação ao receptor ACE2 e subsequente internalização - endocitose - continuou a funcionar efetivamente sob o manto da escuridão para a imagem.

p Na NRL, os pesquisadores também estavam ansiosos para alavancar sua experiência com nanopartículas para entrega celular e biossensorio para ajudar os esforços na busca de drogas anti-COVID19. Oh começou a procurar maneiras possíveis de aplicar as técnicas de conjugação de proteína-nanoestrutura com as quais ela vinha trabalhando há mais de 15 anos. Com duas proteínas que compartilham uma afinidade de ligação - um ponto quântico ligado a uma e uma nanopartícula fluorescente ligada à outra - a ligação entre as duas proteínas trará as nanoestruturas próximas o suficiente para a transferência de energia entre elas.

p A extinção de fluorescência resultante permite então que os pesquisadores monitorem a ligação à proteína. "Se você tiver algum inibidor no meio para interromper a ligação, isso pode ser usado como um ensaio de inibição para triagem de drogas, então usamos muito isso, "explica Oh. Vendo a aplicação potencial para rastrear anticorpos contra COVID19, Oh e sua equipe liderada por Mason Wolak apresentaram suas ideias para a equipe do NCATS, e as duas instituições começaram a trabalhar para desenvolvê-lo ainda mais.

p Desenvolvendo um "pseudovirion"

p O primeiro passo do lado de Oh da colaboração foi desenvolver um "pseudovirion" com as partes potentes das proteínas spike SARS-CoV-2 (onde o domínio de ligação do receptor está situado) ligadas ao ponto quântico de tal forma que as proteínas spike continue a atacar e penetrar nas células como um vírus ativo. Por esta, a orientação das proteínas de pico e a forma do pseudovirion eram fundamentais, e aqui, A vasta experiência de Oh em conjugação de proteínas ativas com nanoestruturas valeu a pena. Antes de passar para os testes de entrega de celular mais caros, eles tiveram que testar se seu pseudovirion estava funcionando fora das células, conjugando nanopartículas de ouro fluorescentes aos receptores ACE2 e monitorando a extinção de fluorescência. Oh lista as múltiplas proporções de proteína para ponto quântico, tamanhos de pontos quânticos e químicas de superfície que eles tentaram antes de finalmente serem capazes de observar a supressão de fluorescência na ligação de proteínas, e estavam prontos para enviar o pseudovirion para a equipe de Gorshkov "para fazer coisas legais com o celular real".

p Para observar o pseudovirion interagindo com ACE2 em uma célula real, o ponto quântico no pseudovirion agora precisava ser projetado para emitir em um comprimento de onda que fosse fácil de distinguir da proteína fluorescente verde na ACE2, em oposição a otimizar a têmpera de nanopartículas. Com os dois sinais claros, a equipe do NCATS conseguiu rastrear a ligação das duas proteínas e a endocitose subsequente. Adicionalmente, eles puderam ver que a ligação e a endocitose foram evitadas na presença de dois anticorpos de teste. Eles poderiam até testar o mecanismo de endocitose, que procede por meio de uma proteína chamada dinamina. Quando eles adicionaram Dyngo-4a, que interrompe a dinamina, eles puderam ver a ligação ocorrer, mas nenhuma endocitose subsequente.

p Os resultados também apontam para um sucesso para colaborações de pesquisa remota, já que as equipes nunca se encontraram. "O tipo de colaboração que temos aqui é raro, "diz Gorshkov, refletindo o quanto seu progresso ultrapassou as colaborações anteriores, onde havia um maior número de reuniões físicas e atividades coordenadas. "Houve um impulso e um foco tão grande de ambos os grupos que realmente houve uma sinergia muito boa."

p O pseudovirion de pontos quânticos é limitado a imagens de penetração celular por endocitose, e resta determinar se este mecanismo entra em vigor para todos os tipos de células, tecido pulmonar em particular. Um mecanismo de ataque alternativo de SARS-CoV-2 é baseado na fusão de membrana, e a imagem disso com o pseudovirion de pontos quânticos exigiria modificações significativas para interagir com a célula mais como uma membrana. Contudo, a taxa de transferência rápida e as observações diretas que o pseudovirion de pontos quânticos possibilita devem representar vantagens significativas na busca por anticorpos. p © 2020 Science X Network