p Os nematocistos são organelas pungentes de cnidários que têm propriedades mecânicas notáveis ​​para sofrer alterações de 50 por cento no volume durante a exocitose explosiva (processo pelo qual as células excretam resíduos e moléculas grandes), ao mesmo tempo que suporta pressões osmóticas além de 100 bar. Os pesquisadores identificaram recentemente dois novos componentes de proteína que construíram a parede do nematocisto em Hydra para incluir (1) uma proteína-1 rica em prolina cnidária (CPP-1) com um motivo de poliprolina rígido, e (2) um Cnidoin elástico possuindo um domínio semelhante a seda. Em um novo estudo, agora Relatórios Científicos , Theresa Bentele e uma equipa de investigadores dos departamentos de Medicina, Evolução Molecular e Genômica e o Instituto de Físico-Química da Alemanha, Austrália e Japão, Cnidoína recombinante expressa e proteínas CPP-1 em Escherichia coli . p Eles compararam o módulo de elasticidade de proteínas em massa espontaneamente reticuladas com o de nematocistos isolados. Os pesquisadores otimizaram sistematicamente a fabricação de nanofibras de proteínas uniformes usando eletrofiação e condições preparativas. Ambas as fibras permaneceram estáveis ​​mesmo após lavagem rigorosa e imersão em água a granel, devido à reticulação simultânea de domínios ricos em cisteína. As nanofibras resultantes eram claramente diferentes de outras nanofibras de proteína que eram instáveis ​​sem procedimentos químicos de reticulação. Após avaliação quantitativa das propriedades mecânicas, eles examinaram aplicações de nanofibras de Cnidoína e CPP-1 para promover o crescimento de células-tronco mesenquimais humanas.

p Nematocistos Hydra compreendem quatro variantes que se desenvolvem na coluna corporal de pólipos em células especializadas conhecidas como nematócitos. A excelente resistência mecânica da estrutura da parede da cápsula torna os nematocistos únicos para formar materiais bioinspirados no laboratório. A cápsula contém complexos de proteínas reticulados por ligações dissulfeto intermoleculares entre domínios ricos em cisteína (CRD), que pode ser usado como um reticulador versátil para criar polímeros lineares ou ramificados entre diversas proteínas. Os cientistas já haviam identificado duas novas proteínas da cápsula, incluindo CPP-1 e Cnidoin, enquanto estudavam nematocistos Hydra em seu trabalho anterior. O potencial de combinar Cnidoína elástica e proteínas rígidas de CPP-1 foi uma estratégia promissora para projetar novos biomateriais capazes de formar estruturas estáveis ​​com reticulação espontânea para obter excelente flexibilidade e resistência, semelhantes às cápsulas de nematocistos biológicos. As nanofibras de proteínas sintéticas com bioinspiração têm ganhado cada vez mais atenção como uma matriz artificial para cultivar células-tronco para aplicações de engenharia de tecidos. A eletrofiação oferece um método comum para fabricar essas fibras usando proteínas de seda, colágeno e gelatina. Os produtos de fibra fina têm múltiplas aplicações na cicatrização de feridas e engenharia de tecidos.

p No presente trabalho, Bentele et al. introduziu uma nova classe de nanofibras sem reticulação sintética com base nas proteínas do nematocisto Hydra CPP-1 e Cnidoína usando eletrofiação. Com base na capacidade de reticulação espontânea dos CRDs, eles otimizaram sistematicamente as condições preparativas para a bioengenharia de nanofibras de proteínas livres de reticulação que são estáveis ​​sob a água com aplicações potenciais para cultura de células-tronco humanas. A equipe de pesquisa obteve imagens representativas de imunofluorescência de um Hydra conjugado com anticorpos CPP-1 (verde) e Cnidoína (vermelho) para co-localizar as proteínas na parede da cápsula. As imagens indicaram a presença de Cnidoína como mais densamente compactada dentro das paredes de nematocistos maduros em comparação com CPP-1. Depois disso, Bentele et al. utilizaram métodos de Western blot para identificar as cápsulas de nematocistos nativos isolados e proteínas recombinantes (proteínas expressas em outros organismos); que eles produziram em E. coli. Os resultados indicaram modificações pós-tradução consideráveis ​​de CPP-1 em Hydra. Eles confirmaram os resultados usando a proteína CPP-1 expressa em E. coli e deduziram que tanto a CPP-1 quanto a Cnidoína eram proteínas estruturais da parede do nematocisto integradas durante a formação ou morfogênese.

p Os pesquisadores então testaram as propriedades mecânicas dos nematocistos Hydra e proteínas em massa usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia de força atômica (AFM). Os cientistas extraíram a distribuição dos módulos elásticos e mediram ainda a elasticidade da CPP-1 recombinante purificada (reCPP-1) e da Cnidoína (reCnidoína) expressa em E. coli. Eles então otimizaram a produção de nanofibras introduzindo polietilenoglicol (PEG) 900 kDa na solução pura para obter maior viscosidade do produto. A equipe investigou a influência da umidade relativa - que afetou significativamente a qualidade das nanofibras, enquanto a força iônica ou condutividade das soluções de fiação não mostraram influência nas nanofibras.

p Com base no desenvolvimento preliminar de materiais e resultados de caracterização, Bentele et al. nanofibras de proteínas fabricadas por eletrofiação da solução de proteína-PEG em lamelas de vidro. As nanofibras recCPP-1-PEG recém-fiadas mostraram uma largura e altura uniformes ao longo de 50 x 50 µm ² área e exibiu um módulo de elasticidade uniforme. A equipe então mediu a topografia da superfície, obteve um mapa de elasticidade e uma curva característica de força-indentação para reCPP-1 e nanofibras de reCnidoína (a) no ar, (b) ao ar após a lavagem com água, e em (c) solução tampão fisiológica. Eles poderiam remover o PEG lavando com água para obter uma espessura de fibra significativamente diminuída para nanofibras de recnidoína, embora as dimensões fossem menos pronunciadas em comparação com reCPP-1 após o tratamento de água.

p Contudo, as fibras não se dissolvem inteiramente após a lavagem com água e retêm seus módulos elásticos. Os resultados sugerem que as duas proteínas recombinantes podem estabelecer nanofibras estáveis ​​formando espontaneamente ligações dissulfeto entre terminais CRD (domínio rico em cisteína). As proteínas recombinantes do nematocisto Hydra produzidas neste trabalho também formaram nanofibras uniformes e estáveis ​​por meio de CRDs de ocorrência natural no ar e em tampão fisiológico. A equipe examinou as aplicações dessas nanofibras com cultura de células-tronco mesenquimais humanas estáveis ​​por 20 dias de incubação, durante o qual aproximadamente 95 por cento das células mostraram crescimento celular e viabilidade nos novos materiais bioinspirados.

p Desta maneira, Theresa Bentele e colegas propuseram um novo biomaterial de nanofibra sem reticulador sintético, bioinspirado pelas proteínas da cápsula do nematocisto de Hydra. Eles expressaram proteínas recombinantes de duas proteínas da cápsula de nematocisto CPP-1 e Cnidoína recentemente identificadas dentro de E. coli e prepararam nanofibras por meio de eletrofiação. Como resultado dos domínios ricos em cisteína (CRD), as fibras submetidas a eletrofiação podem se reticular espontaneamente por meio de ligações dissulfeto. As proteínas recombinantes reCPP-1 e reCnidoína formaram nanofibras uniformes que eram estáveis ​​em água diretamente após a eletrofiação. Os novos materiais construídos demonstraram potencial como materiais biocompatíveis inspirados na resistente e elástica estrutura do nematocisto Hydra. p © 2019 Science X Network