Nas ciências da vida, a capacidade de medir a distribuição de biomoléculas dentro de uma célula in situ é um objetivo investigativo importante. Entre uma variedade de técnicas, os cientistas usaram a imagem magnética (MI) com base no centro de vacância de nitrogênio (NV) em diamantes como uma ferramenta poderosa na pesquisa biomolecular. Contudo, a imagem em nanoescala de proteínas intracelulares tem permanecido um desafio até agora. Em um estudo recente agora publicado em Avanços da Ciência , Pengfei Wang e colegas dos departamentos interdisciplinares de física, biomacromoléculas, informação quântica e ciências da vida na China, usaram proteínas de ferritina para demonstrar a realização MI de proteínas endógenas em uma única célula, usando o centro de vacância de nitrogênio (NV) como o sensor. Eles capturaram imagens de ferritinas intracelulares e organelas contendo ferritina usando MI e microscopia eletrônica correlativa para preparar o caminho para imagens magnéticas em nanoescala (MI) de proteínas intracelulares.

O aumento da resolução espacial existente de imagens biomédicas é necessário para atender às demandas contínuas em imagens médicas, e portanto, entre uma variedade de técnicas, a imagem magnética é de amplo interesse no momento. A ressonância magnética (MRI) é amplamente usada para quantificar a distribuição de spins nucleares, mas a MRI convencional só pode atingir uma resolução de 1 µm em imagens de spin nuclear onde a resolução é limitada pela sensibilidade de detecção elétrica. Os cientistas desenvolveram uma série de técnicas para quebrar essa barreira de resolução, incluindo um dispositivo supercondutor de interferência quântica e microscopia de força de ressonância magnética. No entanto, esses relatórios requerem um ambiente criogênico e alto vácuo para geração de imagens, limitar a implementação experimental e sua tradução para a prática clínica.

Um método de sensoriamento quântico desenvolvido recentemente com base no centro de vacância de nitrogênio no diamante empurrou radicalmente os limites das técnicas de MI em nanoescala para detectar moléculas orgânicas e proteínas em laboratório. Os cientistas combinaram a detecção quântica com centros NV e microscopia de sonda de varredura para demonstrar ressonância magnética em nanoescala para spin único de elétron e conjunto de spin nuclear pequeno, enquanto usam o centro NV como um magnetômetro biocompatível para imagens não invasivas de partículas ferromagnéticas dentro das células na escala subcelular (0,4 µm). Por exemplo, a despolarização do centro NV pode ser usada como um magnetômetro de banda larga para detectar e medir o ruído flutuante de íons metálicos e spins nucleares. Contudo, tal imagem de proteínas únicas via MI em nanoescala não foi relatada na célula única até agora.

No presente trabalho, Wang et al. relataram dois avanços técnicos para permitir MI em nanoescala de proteínas intracelulares dentro de uma única célula. Por esta, eles congelaram a célula em um estado sólido e a segmentaram intrincadamente em uma forma de cubo, em seguida, colocou-o em uma sonda de varredura diapasão de um microscópio de força atômica (AFM) para imagens, onde a seção transversal plana da célula foi exposta ao ar. Os cientistas usaram a configuração de colocação de amostra para permitir que o sensor NV seja posicionado dentro de 10 nm das proteínas alvo e usaram o AFM para suprimir a deriva térmica durante o posicionamento da amostra. Eles, então, projetaram nanopilares trapezoidais em forma de cilindro em uma superfície de diamante para aquisição de imagem, encurtando tecnicamente o tempo de aquisição da imagem em uma ordem em comparação com os métodos anteriores. No presente estudo, os cientistas usaram essa técnica para conduzir MI in situ do ruído flutuante magnético das proteínas de ferritina intracelular (um biomarcador de estoques de ferro e saturação de transferrina no corpo) dentro da configuração experimental.

A ferritina é um complexo de proteína globular com diâmetro externo de 12 nm, contendo uma cavidade medindo 8 nm de diâmetro que permite que até 4.500 átomos de ferro sejam armazenados dentro da proteína. O ruído magnético dos íons férricos pode ser detectado devido aos seus efeitos no T ₁ tempo de relaxamento de um centro NV. Nesse trabalho, Wang et al. confirmou a observação usando medições de fluorescência de decaimento dependente do tempo da população de centros NV (spin magnético, m _S =0 estado), em uma superfície de diamante revestida com ferritinas. Adicionalmente, os cientistas detectaram o ruído magnético com métodos sem etiqueta usando o centro NV via microscopia eletrônica de transmissão (TEM). The work allowed the development of a correlated MI and TEM scheme to obtain and verify the first nanoscale MI of a protein in situ.

The scientists used the hepatic carcinoma cell line (HepG2) for the experiments and studied iron metabolism by treating the cells with ferric ammonium citrate (FAC), which significantly increased the amount of intracellular ferritin. They verified this using confocal microscopy (CFM), western blotting and TEM techniques at first. The results showed the primary localization of ferritins in the intracellular puncta around the nucleus, among the cytoplasm. The scientists used bulk electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy to confirm the paramagnetic properties of ferritin in the FAC-treated HepG2 cells and mass spectroscopy to measure the interference due to other paramagnetic metal ions.

Wang et al. then used ultrafast, high-pressure freezing to immobilize all intracellular components of the Fe-loaded cells. The process stabilized the intracellular structures and molecules by minimizing Brownian motion in cells, which typically contributes to random motion of proteins up to 100 nm in vivo. To image the samples, they embedded and polymerized the frozen cells in LR White medium, followed by gluing the embedded cell sample to the AFM tuning fork with a few cells at the tip. Using a diamond knife, the scientists then sectioned the tip surface to nanometer flatness to examine the cuboid cell section under AFM. They acquired MI images of ferritins by scanning the cell cube along the diamond nanopillars and simultaneously measured NV spin repolarization rate using the "leapfrog" scanning mode of the microscope as detailed previously.

The scientists measured fluorescence decay at a fixed free evolution time of 50 microseconds (τ =50 μs) to reveal the degree of NV sensor spin polarization, which correlated with the amount of ferritin in the sensing volume. They observed the appearance of some clusters via both TEM and MI images, although some details were not observed in MI, the results confirmed that spin noise from intracellular ferritin contributed to depolarize the NV center. In order to obtain details of the ferritin clusters at higher resolution, the scientists minimized the pixel size to 8.3 nm and acquired MI of high resolution of the proteins as expected.

Desta maneira, Wang et al. explored the sensitivity of NV centers as an appropriate sensor for biological imaging applications at the level of the single molecule. They used the technique as a sensor in the experimental setup to obtain the first MI of a protein at a resolution of 10 nm in situ. The scientists aim to improve the stability and sensitivity of the technique to speed up the scanning process and image a larger area of interest in the cell and locate ferritin beyond the nucleus in association with additional organelles.

The work will contribute to clinical diagnostics to determine biomarker-based iron storage and release in cells. This will include studies on the regulatory mechanisms of iron metabolism during the progression of hemochromatosis, anemia, liver cirrhosis and Alzheimer's disease. Wang et al. propose to extend the approach in situ to other cellular components with paramagnetic signals, including magnetic molecules, metalloproteins and special spin-labelled proteins. The scientists envision that further studies will explore additional targets suitable for high-resolution MI and correlated TEM imaging techniques, with optical microscopy detection incorporated to the experimental setup to extend the work and determine protein nuclear spin MRI as well as perform three-dimensional cell tomography.

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