p Às vezes, os métodos da velha escola fornecem as melhores maneiras de estudar tecnologia de ponta e seus efeitos no mundo moderno. p Dando um novo papel a uma técnica de laboratório de 65 anos, pesquisadores do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) realizaram a separação mais limpa até hoje de nanopartículas sintéticas de um organismo vivo. Espera-se que o novo método NIST melhore significativamente os experimentos que examinam os potenciais impactos ambientais e de saúde dessas entidades manufaturadas. Isso permitirá aos cientistas contar com mais precisão quantas nanopartículas foram realmente ingeridas por organismos expostos a elas.

p Um artigo descrevendo o novo método aparece na edição atual da revista. ACS Nano .

p O verme comum Caenorhabditis elegans tem sido usado nos últimos anos como um modelo vivo para estudos de laboratório de como compostos biológicos e químicos podem afetar organismos multicelulares. Esses compostos incluem nanopartículas projetadas (ENPs), bits de material entre 1 e 100 nanômetros (bilionésimos de um metro, ou cerca de 1/10, 000 o diâmetro de um glóbulo vermelho). Pesquisas anteriores frequentemente se concentraram em quantificar a quantidade e o tamanho das nanopartículas engenheiradas ingeridas por C. elegans. Medir as nanopartículas que realmente entram em um organismo é considerado um indicador mais relevante de toxicidade potencial do que apenas a quantidade de ENPs a que os vermes estão expostos.

p Os métodos tradicionais de contagem de ENPs ingeridos produziram resultados questionáveis. Atualmente, pesquisadores expõem C. elegans a ENPs de metal, como prata ou ouro em solução, em seguida, enxágue o excesso de partículas com água, seguido de centrifugação e liofilização. Uma parte da amostra "limpa" produzida é então tipicamente examinada por uma técnica que determina a quantidade de metal presente, conhecido como espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). Muitas vezes resulta em contagens de ENP na ordem de dezenas de milhares por worm; Contudo, esses números sempre parecem altos para os pesquisadores do NIST que trabalham com C. elegans.

p "Como o ICP-MS detectará todas as nanopartículas associadas aos vermes, tanto aqueles ingeridos quanto aqueles que permanecem ligados externamente, suspeitamos que o último é o que torna as contagens por worm de 'ENPs' tão altas, "disse a química analítica do NIST Monique Johnson, o autor principal do artigo ACS Nano. "Como queríamos apenas quantificar os ENPs ingeridos, era necessário um método de separação mais robusto e confiável. "

p Felizmente, a solução para o problema já estava no laboratório.

p No decorrer da cultura de C. elegans para experimentos de exposição a ENP, Johnson e seus colegas usaram centrifugação de gradiente de densidade de sacarose, um sistema estabelecido e com décadas de idade para separar componentes celulares de forma limpa, para isolar os vermes de detritos e bactérias. "Ficamos imaginando se o mesmo processo nos permitiria realizar uma separação organismo-de-ENP também, então projetei um estudo para descobrir, "Disse Johnson.

p Em seu experimento, os pesquisadores do NIST primeiro expuseram amostras separadas de C. elegans a baixas e altas concentrações de dois tamanhos de nanoesferas de ouro, 30 e 60 nanômetros de diâmetro. Os pesquisadores colocaram cada uma das amostras em uma centrífuga e removeram o sobrenadante (porção líquida), deixando os vermes e ENPs nas pelotas restantes. Estes foram centrifugados duas vezes em uma solução salina (em vez de apenas água como nos métodos de separação anteriores), e depois centrifugado novamente, mas desta vez, através de um gradiente de densidade de sacarose projetado exclusivamente.

p "De cima para baixo, nosso gradiente consistia em uma camada de solução de sal para reter o excesso de ENPs e três camadas cada vez mais densas de sacarose [20, 40 e 50 por cento] para isolar C. elegans, "Johnson explicou." Seguimos o gradiente com três enxágues de água e centrifugações para garantir que apenas vermes com ENPs ingeridos, e não o meio de separação de sacarose com qualquer excesso de ENPs, iria torná-lo na pelota final. "

p A análise da faixa de massas nas amostras ultrapurificadas indicou níveis de ouro mais em linha com o que os pesquisadores esperavam que fossem encontrados como ENPs ingeridos. A validação experimental do sucesso do método de separação NIST veio quando os vermes foram examinados em detalhes em um microscópio eletrônico de varredura (MEV).

p "Para mim, o momento eureka foi quando vi pela primeira vez ENPs de ouro nas imagens de seção transversal tiradas das amostras de C. elegans que foram processadas através do gradiente de densidade de sacarose, "Johnson disse." Eu tinha sonhado em encontrar ENPs no trato digestivo do verme e agora eles estavam realmente lá! "

p As imagens SEM de alta resolução também forneceram evidências visuais de que apenas ENPs ingeridos foram contados. "Nenhum ENP foi anexado à cutícula, o exoesqueleto de C. elegans, em qualquer uma das amostras de gradiente de densidade de sacarose, "Disse Johnson." Quando examinamos vermes de nossos experimentos de controle [processados ​​usando o tradicional sem gradiente, método de separação por enxágue com água], foram encontradas várias nanoesferas presas à cutícula.

p Agora que foi demonstrado com sucesso, os pesquisadores do NIST planejam refinar e validar ainda mais seu sistema para avaliar a absorção de ENPs por C. elegans. "Esperançosamente, nosso método se tornará uma ferramenta útil e valiosa para reduzir a variabilidade de medição e o viés de amostragem que pode prejudicar os estudos de nanotoxicologia ambiental, "Disse Johnson.