p Na biossíntese de heme, a etapa terminal é a inserção de ferro ferroso na protoporfirina IX (PPIX) pela enzima ferrochelatase. Sob condições fisiológicas, pequenas quantidades de zinco protoporfirina IX (ZnPP) também são formadas. As concentrações de ZnPP e PPIX em células eritróides são caracteristicamente alteradas por condições que afetam a disponibilidade de ferro ferroso, aumentar as quantidades de PPIX, ou diminuir a atividade enzimática da ferrochelatase. Infelizmente, o método de quantificação padrão baseado em HPLC é demorado e complicado. Alternativas, também, provaram ser tecnicamente exigentes ou complicados para adoção geral. Para medição de ZnPP sozinho, um fluorômetro frontal portátil, o hematofluorômetro, está disponível comercialmente. Ainda, seu uso é limitado por uma alta fluorescência de fundo de outros constituintes do sangue, tornando inevitável a lavagem da amostra. p Uma equipe de pesquisa liderada por Georg Hennig da Klinikum der Universität München (Alemanha) agora desenvolveu um novo método para quantificação simultânea de ZnPP e PPIX em amostras de sangue não lavadas. Baseia-se na excitação de comprimento de onda duplo para eliminar efetivamente a fluorescência de fundo de outros constituintes do sangue. Os resultados obtidos foram intimamente correlacionados com as determinações por um ensaio de HPLC de referência.

p A chave para o sucesso foi a escolha dos comprimentos de onda de excitação apropriados. Ambos devem sofrer absorção virtualmente idêntica e sua separação espectral deve ser pequena, de modo que as profundidades de penetração dos fótons são essencialmente as mesmas. A eficiência de excitação dos fluoróforos responsáveis ​​pela autofluorescência deve diferir apenas por uma pequena quantidade entre os dois comprimentos de onda de excitação, de modo que a subtração do espectro de emissão elimina efetivamente a autofluorescência. Em contraste, o analito fluoróforo deve exibir uma grande diferença na eficiência de excitação entre esses dois comprimentos de onda de excitação, de modo que a diferença entre os espectros de emissão é grande e não elimina o sinal do fluoróforo do analito.

p Este é o caso de 425 nm (o máximo de excitação de fluorescência de ZnPP, emissão máxima em 593 nm) e 407 nm como um comprimento de onda correspondente com absorção de heme oxigenado idêntico, mas substancialmente menor eficiência de excitação de ZnPP. Além disso, conforme o comprimento de onda de excitação em 407 nm se aproxima do máximo de excitação PPIX em 397 nm, o espectro de emissão mostra um pronunciado pico de emissão de fluorescência PPIX, que se encontra a 627 nm. Como a eficiência de excitação PPIX é muito menor em 425 nm, o pico de emissão de fluorescência PPIX não é eliminado no espectro de diferença e pode ser avaliado junto com o sinal ZnPP.

p A nova abordagem poderia ser implementada de forma simples e econômica em um dispositivo para uso em condições de campo. Além disso, pode reduzir a autofluorescência em tecidos, como a mucosa oral in vivo, permitindo medições não invasivas de ZnPP e PPIX. (Texto contribuído por K. Maedefessel-Herrmann)