p (Phys.org) - Pesquisadores do Instituto de Tecnologia da Geórgia e da Universidade da Califórnia em San Francisco possuem a capacidade dos cientistas avançados de visualizar uma imagem clara de uma única estrutura celular em movimento. Ao identificar moléculas usando sensoriamento comprimido, este novo método fornece a resolução espacial necessária além de uma resolução temporal mais rápida do que era possível anteriormente. p Apesar de muitas conquistas no campo da microscopia de super-resolução nos últimos anos com os avanços da resolução espacial, a imagem de células vivas continua sendo um desafio devido à necessidade de alta resolução temporal.

p Agora, Lei Zhu, professor assistente na Escola de Engenharia Mecânica George W. Woodruff da Georgia Tech, e Bo Huang, professor assistente no Departamento de Química Farmacêutica da UCSF e no Departamento de Bioquímica e Biofísica, desenvolveram uma abordagem avançada usando microscopia de super-resolução para resolver características celulares uma ordem de magnitude menor do que o que poderia ser visto antes. Isso permite que os pesquisadores acessem informações anteriormente inacessíveis e respondam a novas questões biológicas.

p A pesquisa foi publicada em 22 de abril, 2012 no jornal Métodos da Natureza . A pesquisa é financiada pelo National Institutes of Health, Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora, Searle Scholarship e Packard Fellowship for Science and Engineering.

p A tecnologia anterior usando a abordagem de comutação de molécula única para microscopia de super-resolução depende de espalhar imagens de molécula única esparsamente em muitos, frequentemente milhares de, quadros de câmera. É extremamente limitado em sua resolução temporal e não fornece a capacidade de seguir processos dinâmicos em células vivas.

p “Agora podemos usar nossa descoberta usando microscopia de super-resolução com segundos ou mesmo resolução temporal abaixo de um segundo para um grande campo de visão seguir muitos processos celulares mais dinâmicos, ”Disse Zhu. “Muito do nosso conhecimento sobre a vida de uma célula vem de nossa capacidade de ver as pequenas estruturas dentro dela.”

p Huang observou, “Um aplicativo, por exemplo, é investigar como as mitocôndrias, a casa de força da célula, interagir com outras organelas e o citoesqueleto para remodelar a estrutura durante o ciclo de vida da célula. ”

p Atualmente, Luz do microscópio, especialmente na forma moderna de microscopia de fluorescência, ainda é usado com frequência por muitos biólogos. Contudo, os autores dizem, a microscopia de luz convencional tem uma grande limitação:a incapacidade de resolver dois objetos mais próximos da metade do comprimento de onda da luz devido ao fenômeno chamado difração. Com difração, as imagens parecem desfocadas e sobrepostas, independentemente da ampliação usada.

p “O limite de difração tem sido considerado uma das restrições fundamentais para a microscopia de luz, até as recentes invenções de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, ”Disse Zhu. Métodos de microscopia de super-resolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) ou microscopia de localização fotoativada (PALM), dependem da capacidade de registrar a emissão de luz de uma única molécula da amostra.

p Usando moléculas de sonda que podem ser alternadas entre um estado visível e um invisível, STORM / PALM determina a posição de cada molécula de interesse. Em última análise, essas posições definem uma estrutura.

p A nova descoberta é significativa, disse Zhu e Huang, porque eles mostraram que a tecnologia permite seguir a dinâmica de um citoesqueleto de microtúbulo com uma resolução de tempo de três segundos, o que permitiria aos pesquisadores estudar os transportes ativos de vesículas e outras cargas dentro da célula.

p Usando o mesmo sistema óptico e detector da microscopia de luz convencional, a microscopia de super-resolução naturalmente requer um tempo de aquisição mais longo para obter mais informações espaciais, levando a um trade-off entre sua resolução espacial e temporal. Em métodos de microscopia de super-resolução baseados em STORM / PALM, cada imagem de câmera mostra um subconjunto muito esparso de moléculas de sonda na amostra.

p Uma abordagem alternativa é aumentar a densidade de fluoróforos ativados de modo que cada quadro de câmera amostre mais moléculas. Contudo, esta alta densidade de pontos fluorescentes faz com que eles se sobreponham, invalidando o método de localização de molécula única amplamente utilizado.

p Os autores disseram que uma série de métodos foram relatados recentemente que podem recuperar de forma eficiente as posições de uma única molécula, mesmo quando os sinais de um único fluoróforo se sobrepõem. Esses métodos são baseados no ajuste de clusters de pontos sobrepostos com um número variável de funções de propagação de pontos (PSFs) com estimativa de máxima verossimilhança ou estatística Bayesiana. O método Bayesiano também foi aplicado a todo o conjunto de imagens.

p Como resultado de novas pesquisas, Zhu e Huang apresentam uma nova abordagem baseada na otimização global usando sensoriamento comprimido, que não envolve estimar ou assumir o número de moléculas na imagem. Eles mostram que o sensoriamento comprimido pode funcionar com densidades de moléculas muito maiores em comparação com outras tecnologias e demonstrar imagens de células vivas de microtúbulos marcados com proteínas fluorescentes com resolução temporal de três segundos.

p O experimento STORM usado pelos autores, com microtúbulos imunocorados em células S2 de Drosophila melanogaster, demonstraram que microtúbulos próximos podem ser resolvidos por detecção comprimida usando apenas 100 quadros de câmera, ao passo que eles não eram discerníveis pelo método de adaptação de uma única molécula. Eles também realizaram STORM vivo em células S2 que expressam estavelmente tubulina fundida a mEos2.

p Na taxa de quadros da câmera comumente usada de 56,4 Hertz, um filme de super-resolução foi construído com uma resolução de tempo de três segundos (169 quadros) e uma resolução de Nyquist de 60 nanômetros, muito mais rápido do que relatado anteriormente, disse Zhu e Huang. Esses resultados provaram que o sensoriamento comprimido pode permitir que o STORM monitore processos celulares ao vivo com resolução de tempo de segunda escala, ou mesmo resolução em escala inferior a um segundo se uma câmera mais rápida puder ser usada.