Um grupo de pesquisa liderado por Takashi Saito, da Ehime University Graduate School of Medicine, desenvolveu um microscópio de fluorescência de folha de luz de excitação de 2 fótons que (1) reduz a fototoxicidade, (2) estende o campo de visão, e (3) aumenta a resolução espacial. Este microscópio, quando usado para a observação de peixes medaka, tornou possível observar todo o corpo do embrião (um campo de visão estendido) em uma resolução de nível celular (alta resolução espacial) sem afetar o crescimento dos peixes (baixa fototoxicidade) ao longo de um período de três dias de desenvolvimento embrionário. Este resultado foi publicado na revista científica Nature Communications .

O microscópio de fluorescência é amplamente utilizado no campo das ciências da vida para observar moléculas dentro de uma célula de forma não invasiva. A microscopia de fluorescência de lâmina de luz possibilita o registro de imagens tridimensionais com alta velocidade de aquisição e alta resolução espacial. Contudo, em microscópios de folha de luz convencionais, é difícil limitar o fotodano aos tecidos vivos, e também difícil de atingir simultaneamente amplo FOV e alta resolução espacial (nível de célula).

Desenvolvimento de um campo amplo de excitação de dois fótons, microscópio de folha de luz

O grupo de pesquisa da Universidade Ehime de Takashi Saitou, Sota Takanezawa, e Takeshi Imamura utilizou o fenômeno de excitação de dois fótons como uma chave para resolver esse problema. O microscópio de excitação de dois fótons com lasers infravermelhos permite imagens suaves (baixa fototóxica) de organismos vivos. Contudo, porque a luz deve ser focada em uma faixa estreita para induzir a excitação de dois fótons, a faixa de excitação (no microscópio de folha de luz, o campo de visão) é estreito. Para resolver isso, os pesquisadores desenvolveram uma unidade óptica de iluminação simples com um feixe de Bessel que expande a faixa de propagação do laser na direção do eixo óptico (Fig. 1A). Esta unidade pode esticar o comprimento do feixe para 600-1000 μm, mantendo uma resolução axial de 2-3 μm ao usar uma lente objetiva NA0.3 com ampliação de 10x. Usando esta unidade óptica, eles construíram uma microscopia de folha de luz de excitação de dois fótons (Fig. 1B), o que torna possível realizar imagens de corpo inteiro de larvas de medaka com resolução celular (Fig. 1C).

O medaka é amplamente utilizado como organismo modelo para vertebrados. É adequado para imagens fluorescentes, uma vez que é pequeno e transparente. Para avaliar a aplicabilidade do microscópio para uso em organismos vivos, os pesquisadores realizaram uma avaliação de fototoxicidade. Isso revelou fotodano reduzido em comparação com o microscópio de folha de luz de feixe gaussiano convencional. Portanto, é sugerido que seja adequado para imagens ao vivo de longo prazo. Os pesquisadores então aplicaram imagens de lapso de tempo de longo prazo do medaka transgênico em que o endotélio linfático é marcado com proteína fluorescente verde, e obteve sucesso em imagens ao vivo por três dias em intervalos de cinco minutos (Fig. 2).

Neste estudo, os pesquisadores desenvolveram um novo microscópio de fluorescência de folha de luz de alto desempenho. Usando esta tecnologia, os cientistas podem observar quase todos os processos de crescimento embrionário do peixe medaka com alta resolução celular em todo o corpo do peixe. Espera-se que esta tecnologia contribua para a compreensão em nível molecular do desenvolvimento embrionário, a elucidação da patogênese para doenças relacionadas ao estilo de vida, e para promover a tecnologia de desenvolvimento de medicamentos.