A capacidade de multiplexação da microscopia de fluorescência é severamente limitada pela ampla largura espectral de fluorescência. A imagem espectral oferece soluções potenciais, ainda assim, as abordagens típicas para dispersar os espectros de emissão locais impedem notavelmente a taxa de transferência atingível e colocam restrições substanciais na resolução temporal. Filtros de passagem de banda ajustáveis ​​fornecem a possibilidade de varrer o comprimento de onda de emissão no campo amplo. Contudo, a aplicação de passagens estreitas à emissão de fluorescência resulta no uso ineficiente do sinal escasso.

Em um novo artigo publicado em Light:Ciência e Aplicações , uma equipe de cientistas, liderado pelo Professor Ke Xu da Faculdade de Química, Universidade da Califórnia, Berkeley, EUA demonstraram que usando um único, banda fixa de detecção de emissão de fluorescência, por meio de varredura rápida sincronizada de quadro do comprimento de onda de excitação de uma lâmpada branca por meio de um filtro sintonizável acústico-óptico (AOTF), até 6 alvos subcelulares, marcado por fluoróforos comuns de sobreposição espectral substancial, podem ser capturados simultaneamente em células vivas com baixa (~ 1%) diafonia e alta resolução temporal (até ~ 10 ms).

A capacidade demonstrada de quantificar as abundâncias de diferentes fluoróforos na mesma amostra por meio da desmistura dos espectros de excitação permitiu-lhes conceber novos, esquemas de imagem quantitativa para biossensores fluorescentes de dois estados e FRET (transferência de energia de ressonância Förster) em células vivas. Assim, eles alcançaram altas sensibilidades full-frame e resoluções espaço-temporais na quantificação do pH da matriz mitocondrial e o apinhamento macromolecular intracelular. Eles, portanto, revelaram heterogeneidades espaciais significativas em ambos os parâmetros, incluindo saltos repentinos espontâneos no pH da matriz mitocondrial acompanhados por mudanças dramáticas na forma mitocondrial. Eles demonstraram ainda, pela primeira vez, a multiplexação da imagem de pH absoluto com três organelas / proteínas alvo adicionais para elucidar o complexo, Via mitofágica mediada por Parkin.

"A extensão potencial de nossa abordagem para ainda mais fluoróforos pode ser alcançada aumentando ainda mais o número de comprimentos de onda de excitação ou integrando a dispersão de emissão. Enquanto neste trabalho nos concentramos em um sistema fácil baseado em um microscópio de epifluorescência operado por lâmpada, os recursos de imagem de biossensor quantitativo e multi-fluoróforo rápido que demonstramos aqui devem ser prontamente extensíveis a outros sistemas, incluindo microscopia de fluorescência de folha de luz e microscopia de iluminação estruturada ", comentaram os cientistas.

Juntos, esses resultados "revelam as oportunidades excepcionais que a microscopia espectral de excitação fornece para imagens de fluorescência altamente multiplexadas. A perspectiva de adquirir imagens espectrais rápidas no campo amplo sem a necessidade de dispersão de fluorescência ou o cuidado com a resposta espectral do detector oferece um potencial tremendo, "concluem os cientistas.