uma, Diagrama de energia de STED-SREF. b, Configuração de espectroscopia de STED-SREF. O modo nitrílico da Rodamina 800 (Rh800) é usado aqui. c, Imagem SREF / STED-SREF de células de E. coli coradas com Rh800 com comprimentos de onda da bomba ajustados em 836 nm (ressonância desligada do modo nitrila) e 838 nm (ressonância vibracional do modo nitrila). O acoplamento direto da depleção de emissão estimulada (STED) com a imagem SREF falha em alcançar as melhorias de resolução desejadas. O fundo de fluorescência anti-Stokes (mostrado na bomba SREF =836 nm) tem um papel indesejado na prevenção da adoção direta da técnica de fluorescência de super-resolução. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
A imagem de super-resolução verdadeira além do limite de difração continua sendo um grande desafio para a microscopia Raman de campo distante, especialmente em aplicações biológicas. Aproveitando a fluorescência excitada Raman estimulada (SREF) como um contraste vibracional ultrassensível, uma equipe da Columbia University inventou recentemente uma nova microscopia vibracional de super-resolução. Seu novo método abre super-resolução, imagem vibracional multicolorida de resolução espectral nanométrica de sistemas biológicos.
Tem sido uma longa busca desenvolver técnicas de imagem de super-resolução para microscopia Raman, que tem vantagens intrínsecas de especificidade química sobre sua contraparte de fluorescência. Apesar da importância percebida e extensos esforços de pesquisa, A verdadeira super-resolução (definida como difração ilimitada) A imagem Raman de sistemas biológicos no campo distante óptico permanece um desafio devido à deficiência de sensibilidade para espalhamento Raman convencional. Consequentemente, aqueles métodos de imagem vibracional de super-resolução relatados são baseados na saturação de excitação, esgotando, ou não linearidade de ordem superior das transições Raman. Estes requerem uma potência de laser extremamente intensa para alcançar uma melhoria moderada de resolução (muitas vezes menos do que um fator de 2), o que inibe sua utilidade para aplicação biológica.
Em um novo artigo publicado em Light:Ciência e Aplicações , uma equipe de cientistas, liderado pelo professor Wei Min da Universidade de Columbia, EUA, desenvolveu uma nova microscopia vibracional de super-resolução que aproveita a fluorescência excitada Raman estimulada (SREF) como um contraste vibracional ultrassensível. O SREF acopla a excitação vibracional com a detecção de fluorescência e permite a espectroscopia Raman de campo distante com sensibilidade até molécula única. Contudo, o acoplamento direto da depleção de emissão estimulada (STED) com a imagem SREF falha em alcançar a imagem de super-resolução devido à presença do fundo de fluorescência anti-stokes, que não pode ser esgotado pelo feixe STED.
uma, o espectro SREF bruto do modo de nitrila Rh800 adquirido por excitação SREF convencional (curva vermelha) e o espectro FM-SREF livre de fundo correspondente adquirido por excitação FM-SREF. b, a imagem FM-SREF e a imagem de espalhamento Raman estimulado por pré-ressonância eletrônica (epr-SRS) de células de E. coli coradas com Rh800. c, a distribuição de intensidade correspondente para FM-SREF e epr-SRS ao longo das linhas tracejadas brancas correspondentes em (b). d, estruturas químicas dos dois corantes SREF empregados. e, os espectros de absorção (curvas sólidas) e espectros de emissão (curvas de traço) dos dois corantes em água, que não são resolvidos para espectroscopia de fluorescência convencional. f, os espectros FM-SREF dos modos de nitrila dos dois corantes. g, imagem multicolor FM-SREF de células de S. cerevisiae. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Neste novo trabalho, a equipe desenvolveu uma estratégia de modulação de frequência (FM) para remover esse fundo de banda larga. Modulando temporariamente a frequência de excitação ligada e desligada da ressonância vibracional alvo, mas ainda dentro da ampla largura de linha do fundo, eles podem gerar uma modulação de intensidade no sinal vibracional puro (mas não no fundo). O sinal vibracional sem fundo pode ser subsequentemente demodulado por uma detecção de bloqueio. Comparando com o espectro SREF bruto típico, o espectro adquirido por FM-SREF representa o sinal SREF puro, que permite imagens SREF de alto contraste e sem fundo. Eles sintetizaram ainda novos corantes SREF editados por isótopos para facilitar a imagem biológica FM-SREF multicolorida com contraste vibracional nítido. Duas cores vibracionais são separadas por FM-SREF com cross-talk mínimo, o que é quase impossível por microscopia de fluorescência convencional. Essa especificidade química da imagem vibracional tem vantagens exclusivas para a imagem óptica multiplexada.
uma, o diagrama do sistema de microscopia STED-FM-SREF. b, imagem das mesmas células de E. coli coradas com Rh800 por microscopia FM-SREF e microscopia STED-FM-SREF e as distribuições de intensidade correspondentes ao longo das linhas tracejadas. c, imagem do mesmo núcleo de células Cos7 corado com composto A por microscopia FM-SREF e microscopia STED-FM-SREF e as distribuições de intensidade correspondentes ao longo das linhas tracejadas. Crédito:Hanqing Xiong †, Naixin Qian †, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Finalmente, integrando STED com FM-SREF sem fundo, eles realizaram imagens vibracionais de super-resolução de alto contraste com STED-FM-SREF, cuja resolução espacial é determinada apenas pela relação sinal-ruído. Eles demonstraram uma melhora na resolução de mais de duas vezes em sistemas biológicos com potência moderada de excitação do laser. Com otimização futura na instrumentação e sondas de imagem, A microscopia STED-FM-SREF foi concebida para auxiliar uma ampla variedade de aplicações biológicas, com sua resolução excelente, alta sensibilidade, contraste vibracional único, e poder de excitação biocompatível.
