Imagens de fluorescência confocal de superfícies de vidro revestidas com os corantes de cianina Alexa Fluor 647 (a) e CF660C (b) e com o corante carborodamina ATTO647N (c) após excitação de luz a 568 nanômetros (nm). Ao excitar os corantes que absorvem o vermelho em 640 nm em certas áreas (imagens negativas no canto superior direito), os corantes são fotoconvertidos ali e é possível escrever letras na superfície que foram excitadas a 568 nm e fluorescentes a cerca de 580 nm. O corante carborodamina apresenta fotofotografia mais eficiente do que os corantes de cianina. Crédito:Equipe Markus Sauer / Universidade de Würzburg
Os mais recentes desenvolvimentos em microscopia de fluorescência tornam possível a imagem de moléculas individuais em células ou complexos moleculares com uma resolução espacial de até 20 nanômetros. Contudo, Sob certas circunstâncias, ocorre um efeito que falsifica os resultados:a luz laser usada pode causar a formação de moléculas de oxigênio muito reativas na amostra. Isso pode danificar os corantes fluorescentes usados a tal ponto que eles não fluorescem mais. Entre os especialistas em microscopia, este efeito é conhecido como fotodegradação.
Contudo, vários corantes fluorescentes também podem ser transformados por fotodegradação para que absorvam luz de comprimentos de onda mais curtos. "Um corante fluorescente anteriormente vermelho brilha em verde. Sua fluorescência foi deslocada para a faixa azul na escala de comprimento de onda. É por isso que esse efeito é chamado de fotoblueing, "explica o professor Markus Sauer, um especialista em microscopia de super-resolução do Biocentro de Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) na Baviera, Alemanha.
Primeira descrição exata do fotoblueing
A equipe de Sauer agora apresenta o mecanismo molecular exato de fotoblueing para corantes de cianina como Cy5 pela primeira vez na revista Métodos da Natureza . O Dr. Martin Schnermann, do Center for Cancer Research em Frederick (EUA), também está envolvido na publicação.
"Porque entendemos o mecanismo com tanta precisão, fomos capazes de prevenir o fotoblueing por meio de aditivos simples, como a vitamina C, ou aumentá-lo com a adição de uma espécie de catalisador, "diz Markus Sauer.
Prevenir o fotoblueing pode ser muito importante. Embora o efeito possa afetar apenas uma pequena porcentagem do corante usado, pode, no entanto, levar a erros ou interpretações errôneas da microscopia, por exemplo, em experimentos de transferência de energia (FRET). Isso ocorre porque os corantes convertidos são detectados com a mesma alta sensibilidade dos produtos iniciais.
Buffers simples evitam fotoblueing
"Nossos resultados mostram quais corantes são afetados e como o fotoblueing pode ser evitado por simples adições de tampão, "Sauer diz, em relação ao conteúdo do Métodos da Natureza papel. "Mas eles também mostram como o fotoblueing pode ser usado de forma vantajosa para imagens de fluorescência e para rastreamento único, moléculas de corante convertidas especificamente. "
Isso é exatamente o que a equipe de Sauer planeja abordar a seguir:Photoblueing deve ser desenvolvido para, entre outras coisas, o rastreamento direcionado de partículas bacterianas e virais individuais em processos de infecção. O trabalho aqui descrito foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa DFG.
