A microscopia de fluorescência é amplamente usada em bioquímica e ciências da vida porque permite que os cientistas observem diretamente as células e certos compostos dentro e ao redor delas. As moléculas fluorescentes absorvem a luz dentro de uma faixa de comprimento de onda específica e a reemitem na faixa de comprimento de onda mais longa. Contudo, a principal limitação das técnicas convencionais de microscopia de fluorescência é que os resultados são muito difíceis de avaliar quantitativamente; A intensidade da fluorescência é significativamente afetada pelas condições experimentais e pela concentração da substância fluorescente. Agora, um novo estudo feito por cientistas do Japão está definido para revolucionar o campo da microscopia de fluorescência de vida.

Uma maneira de contornar o problema convencional é se concentrar no tempo de vida da fluorescência em vez da intensidade. Quando uma substância fluorescente é irradiada com uma pequena explosão de luz, a fluorescência resultante não desaparece imediatamente, mas na verdade "decai" com o tempo de uma forma que é específica para aquela substância. A técnica de microscopia de tempo de vida de fluorescência alavanca esse fenômeno, que é independente das condições experimentais, para quantificar moléculas fluorescentes e mudanças em seu ambiente. Contudo, o decaimento da fluorescência é extremamente rápido, e câmeras comuns não podem capturá-lo. Embora um fotodetector de ponto único possa ser usado em seu lugar, ele deve ser escaneado em toda a área da amostra para ser capaz de reconstruir uma imagem 2-D completa de cada ponto medido. Este processo envolve movimento de peças mecânicas, o que limita bastante a velocidade de captura da imagem.

Neste estudo recente, publicado em Avanços da Ciência , a equipe de cientistas desenvolveu uma nova abordagem para adquirir imagens de duração da fluorescência sem a necessidade de varredura mecânica. Professor Takeshi Yasui, do Institute of Post-LED Photonics (pLED), Universidade Tokushima, Japão, quem liderou o estudo, diz, "Nosso método pode ser interpretado como mapeamento simultâneo de 44, 400 'cronômetros' baseados em luz em um espaço 2-D para medir tempos de vida de fluorescência - tudo em um único disparo e sem digitalização. "

Um dos principais pilares de seu método é o uso de um pente de frequência óptica como luz de excitação da amostra. Um pente de frequência óptica é essencialmente um sinal de luz composto da soma de muitas frequências ópticas discretas com um espaçamento constante entre elas. A palavra "pente" neste contexto se refere à aparência do sinal quando plotado em relação à frequência ótica:um aglomerado denso de pontas equidistantes subindo do eixo da frequência ótica e se assemelhando a um pente de cabelo. Usando equipamento óptico especial, um par de sinais de combinação de frequência de excitação é decomposto em sinais de batida ótica individuais (batidas óticas de pente duplo) com diferentes frequências de modulação de intensidade, cada um carregando uma única frequência de modulação e irradiado na amostra alvo. A chave aqui é que cada feixe de luz atinge a amostra em um local espacialmente distinto, criar uma correspondência um a um entre cada ponto na superfície 2-D da amostra (pixel) e cada frequência de modulação das batidas ópticas dual-comb.

Por causa de suas propriedades de fluorescência, a amostra reemite parte da radiação capturada enquanto preserva a correspondência posição-frequência. A fluorescência emitida pela amostra é então simplesmente focada usando uma lente em um fotodetector de ponto único de alta velocidade. Finalmente, o sinal medido é transformado matematicamente no domínio da frequência, e o tempo de vida da fluorescência em cada "pixel" é facilmente calculado a partir do atraso de fase relativo que existe entre o sinal de excitação naquela frequência de modulação versus aquele medido.

Graças à sua velocidade superior e alta resolução espacial, o método de microscopia desenvolvido neste estudo tornará mais fácil explorar as vantagens das medições do tempo de vida da fluorescência. "Como nossa técnica não requer digitalização, uma medição simultânea em toda a amostra é garantida em cada tiro, "diz o Prof. Yasui, "Isso será útil nas ciências da vida, onde observações dinâmicas de células vivas são necessárias." Além de fornecer uma visão mais profunda dos processos biológicos, esta nova abordagem pode ser usada para imagens simultâneas de várias amostras para teste de antígeno, que já está sendo usado para o diagnóstico de COVID-19.

Talvez o mais importante, este estudo mostra como pentes de frequência óptica, que estavam sendo usados ​​apenas como "réguas de frequência, "pode ​​encontrar um lugar nas técnicas de microscopia para inovar nas ciências da vida. É uma promessa para o desenvolvimento de novas opções terapêuticas para tratar doenças intratáveis ​​e aumentar a expectativa de vida, beneficiando assim toda a humanidade.