Um grande esforço colaborativo que tem se desenvolvido nos últimos três anos entre a ASU e cientistas europeus, resultou em um avanço técnico significativo nas estratégias de amostras cristalográficas de raios-X.

A contribuição da ASU vem da Escola de Ciências Moleculares (SMS), departamento de física e o Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

O laser europeu de elétrons livres de raios-X (EuXFEL) é um centro de pesquisa de superlativos:ele gera pulsos de raios-X ultracurtos — 27, 000 vezes por segundo e com um brilho um bilhão de vezes maior que o das melhores fontes convencionais de radiação de raios-X. Após dez anos de construção, foi aberto para experimentos iniciais no final de 2017. O grupo de Alexandra Ros, professor em SMS da ASU foi premiado com a segunda alocação de tempo de feixe entre concorrentes mundiais.

Seus resultados, publicado em 9 de setembro em Nature Communications , validou um gerador de gotículas microfluídicas exclusivo para reduzir o tamanho da amostra, bem como o desperdício (que pode chegar a 99 por cento) nos experimentos de Cristalografia Femtosegundo em Série (SFX) de sua equipe. Usando isso, eles determinaram a estrutura cristalina da enzima 3-desoxi-d-manno-octulosonato 8-fosfato sintase (KDO8PS) e revelaram novos detalhes em uma região de loop previamente indefinida da enzima que é um alvo potencial para estudos de antibióticos.

"Estamos entusiasmados que este trabalho, resultado de um grande esforço colaborativo, foi bem recebido na comunidade XFEL, "explicou Ros." Estamos desenvolvendo ainda mais este método e buscando a sincronização das gotículas microfluídicas com os pulsos de XFELs. Neste exato momento, uma pequena equipe de alunos da ASU acaba de concluir os experimentos na Linac Coherent Light Source (LCLS) no SLAC National Accelerator Laboratory em Menlo Park, CA para refinar o método. Não poderia ter havido melhor momento para a publicação de nosso trabalho. "

O SLAC é a instalação XFEL mais conhecida dos cientistas dos EUA onde o agora famoso trabalho sobre cristalografia de nanocristais de proteína (pela equipe ASU liderada pelos professores John Spence e Petra Fromme) foi realizado. SLAC e seu companheiro na Europa, também em Hamburgo, têm tido muito sucesso e, conseqüentemente, ficaram com muitas reservas em excesso. A entrada em operação da nova instalação, com seu túnel do acelerador gigante de 2,6 milhas e resolução de escala de comprimento atômico, aliviou parte da demanda nas outras instalações, ao mesmo tempo que oferece novas possibilidades nas ciências físicas.

SFX é uma técnica promissora para determinação da estrutura de proteínas, onde um fluxo líquido contendo cristais de proteína é cruzado com um feixe XFEL de alta intensidade que é um bilhão de vezes mais brilhante do que as fontes tradicionais de raios-X síncrotron.

Embora os cristais sejam destruídos pelo intenso feixe XFEL imediatamente após terem difratado, a informação de difração pode, notavelmente, ainda pode ser gravado graças aos detectores de última geração. Novos métodos de análise de dados poderosos foram desenvolvidos, permitindo que uma equipe analise esses padrões de difração e obtenha mapas de densidade de elétrons e informações estruturais detalhadas de proteínas.

O método é especificamente atraente para proteínas difíceis de cristalizar, como proteínas de membrana, uma vez que produz informações estruturais de alta resolução de micro e até nanocristais, reduzindo assim a contribuição dos defeitos do cristal e evitando o tedioso (senão impossível) crescimento dos grandes cristais exigidos pela cristalografia tradicional baseada em síncrotron.

Embora a cristalografia com XFELs tenha sido uma técnica poderosa para desvendar as estruturas de grandes complexos de proteínas e também permitir a cristalografia resolvida no tempo, essa ciência de ponta, no entanto, gera um grande problema. Por causa da pequena taxa de "acerto", requer grandes quantidades de proteína suspensa, que embora não seja irradiado, são difíceis de recuperar para a maioria das amostras de proteínas. Até 99% da proteína pode ser desperdiçada.

Aqui está o grande avanço técnico feito por Ros e sua equipe. Eles desenvolveram um dispositivo microfluídico impresso em 3D, que é de alta resolução, e gera gotículas aquosas em óleo de segmentação de gotículas variável que podem ser sincronizadas com os pulsos de laser de elétrons livres. Isso reduz drasticamente a quantidade de proteína purificada necessária para o experimento europeu XFEL do requisito atualmente típico (e quase inacessível) de 1 g para o registro do conjunto de dados completo.

A importância desse desenvolvimento merece ser reafirmada. A abordagem dos pesquisadores intercala "lesmas" de líquido carregado de amostra dentro de um líquido de sacrifício, de modo que um microjet líquido de movimento rápido é mantido com a amostra presente apenas durante a exposição aos pulsos de femtossegundo XFEL (um milionésimo de um bilionésimo de um segundo de duração).

A equipe de cientistas demonstrou a geração de gotículas das suspensões de cristal da enzima KDO8PS com o gerador de gotículas microfluídicas e mostrou que a frequência de geração de gotículas pode ser controlada pelas taxas dos fluxos aquoso e de óleo. A qualidade de difração dos cristais de KDO8PS é semelhante tanto quando injetados em gotículas aquosas rodeadas por óleo ou por injeção contínua com um Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), com redução de ~ 60% no consumo de amostra obtido com a injeção de gotas.

A estrutura determinada revelou novos detalhes em uma região de loop previamente indefinida de KDO8PS, um alvo potencial para estudos com antibióticos. Esses resultados defendem a integração futura de rotina de geração de gotículas por fluxo de óleo segmentado em outros XFELs em todo o mundo.