Uma nova técnica desenvolvida por pesquisadores do Centro ARC de Excelência para BioFotônica em nanoescala (CNBP) ajudará a lançar uma nova luz sobre as questões biológicas, melhorando a qualidade e a quantidade de informações que podem ser extraídas em microscopia de fluorescência.

A tecnica, 'microscopia multicanal assistida por branqueamento' (BAMM) pega um ponto fraco atual de longa data da microscopia de fluorescência - fotodegradação - e o transforma em uma força que melhora a produção de imagem em até três vezes, sem nenhum hardware adicional necessário.

Reportado no jornal Biomedical Optics Express , O BAMM ajudará os pesquisadores a obter insights biológicos sobre os intrincados processos que ocorrem nas células vivas. Isso inclui a interação entre proteínas e moléculas que têm o potencial de impactar uma ampla gama de áreas da saúde, desde a fertilidade, para dor, a doenças cardíacas e muito mais.

"A microscopia de fluorescência é uma das técnicas mais amplamente utilizadas na biologia. É aqui que as moléculas emissoras de luz chamadas fluoróforos são ligadas a alvos celulares extremamente pequenos, como proteínas, material genético ou outras biomoléculas de interesse, "diz o Dr. Antony Orth, Pesquisador CNBP da Universidade RMIT e autor principal do artigo de pesquisa.

"Quando o fluoróforo é excitado pela luz do microscópio, ele reage emitindo uma assinatura de cor específica. Ver essa assinatura de cor sob o microscópio nos ajuda a ver, rastrear e compreender o alvo celular ao qual o fluoróforo foi ligado. "

Notavelmente diz o Dr. Orth, você pode anexar fluoróforos de diferentes cores a diferentes alvos celulares, tudo em uma amostra, para maximizar os dados e informações de imagem que são recebidos.

Esta abordagem tradicional para microscopia de fluorescência é versátil, mas há uma limitação importante:o espectro visível (ou de cores), onde a maioria dos fluoróforos operam, pode ficar lotado. Em um experimento ideal, cada alvo deve ser escolhido para ter uma emissão de cor distinta, mas isso se torna cada vez mais difícil de organizar à medida que o número de alvos aumenta.

"O espectro de cores visíveis abrange uma faixa de 400 nanômetros (nm) a 700 nm e apenas cerca de 200 nm desta faixa está disponível para emissão de cor de fluorescência, "explica o Dr. Orth.

"Um fluoróforo típico emite mais de 50 nm do espectro de cores. Dividir 200 nm do espectro visível em segmentos de 50 nm significa que as cores dos emissores fluorescentes começam a se misturar quando você tenta comprimir mais de quatro cores."

"Isso geralmente limita os pesquisadores a quatro ou menos alvos fluorescentes em uma amostra, "diz o Dr. Orth.

"Tipicamente, a maioria dos experimentos são ainda menos ambiciosos, incorporando apenas dois ou três alvos. O cerne do problema é que apenas uma propriedade do fluoróforo - sua cor - está sendo usada para identificação. "

Para ajudar a superar essa limitação, Dr. Orth e seus co-pesquisadores desenvolveram uma técnica inovadora chamada 'microscopia multicanal assistida por clareamento' (BAMM) para aumentar a produção de imagem.

"Em vez de usar cores para diferenciar os fluoróforos, usamos a quarta dimensão do tempo e exploramos um fenômeno chamado fotobranqueamento - o escurecimento de uma coleção de fluoróforos ou pigmentos sob exposição repetida à luz, "diz o Dr. Orth.

"Porque cada tipo de foto-branqueamento de fluoróforo em uma taxa diferente, podemos diferenciar entre os fluoróforos sem usar nenhuma informação de cor. Usamos a taxa de fotodegradação como identificador. "

"Quando combinado com informações de cores tradicionais, esta dimensão adicional de foto-branqueamento permite aos cientistas usar 2 a 3 vezes mais tipos de moléculas fluorescentes, tudo em uma amostra. Isso nos permite extrair muito mais informações de uma única investigação. "

"Os pesquisadores serão capazes de projetar testes mais informativos - por exemplo, destacando cinco alvos quando apenas dois eram práticos. Eles não terão mais que evitar o uso de dois fluoróforos com a mesma cor, uma vez que uma diferença na fotoestabilidade por si só é suficiente para distinguir entre os dois alvos, " ele diz.

Tradicionalmente, o fenômeno de fotobranqueamento (ou desbotamento) tem sido prejudicial para o processo de microscopia fluorescente. É aqui que a iluminação de alta intensidade e contínua do microscópio destrói permanentemente a capacidade do fluoróforo de fluorescência, de modo que a imagem do alvo da célula se torna impossível.

"O BAMM transforma a fotodegradação de uma fraqueza de longa data da microscopia de fluorescência em uma força significativa para permitir maior identificação de alvos celulares, "diz o Dr. Orth.

"O BAMM não requer nenhum hardware adicional, é comparativamente simples de fazer e não requer nenhuma preparação de amostra especializada. É uma nova abordagem extremamente empolgante que tem o potencial de beneficiar todos os usuários de microscopia de fluorescência e sua ciência exploratória, " ele diz.

Pesquisadores formalmente envolvidos com o projeto BAMM eram afiliados ao CNBP (RMIT University e University of Adelaide) e Thermo Fisher Scientific.