PB430 consiste em um esqueleto conjugado Ï € totalmente fundido com uma unidade de óxido P de fosfolo que aceita elétrons, que é responsável por sua alta fotoestabilidade. O ácido carboxílico da molécula pode ser convertido no éster N-hidroxilsuccinimidil (NHS), que permite a conjugação a biomoléculas. Grupos sulfonato garantem alta solubilidade da molécula em água. Crédito:ITbM, Universidade de Nagoya
Químicos da ITbM, A Universidade de Nagoya desenvolveu um corante fluorescente super-fotoestável chamado PhoxBright 430 (PB430) para visualizar a ultra-estrutura celular por microscopia de super-resolução. A fotoestabilidade excepcional deste novo corante permite imagens STED contínuas. Com sua capacidade de marcar proteínas com rótulos fluorescentes, PB430 demonstra seu uso na construção 3-D e imagens multicoloridas de estruturas biológicas.
Microscopia de fluorescência de super-resolução, que recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014, permite aos pesquisadores visualizar sistemas biológicos e obter uma compreensão detalhada da complexa dinâmica das biomoléculas. Em particular, A microscopia de esgotamento de emissão estimulada (STED) é amplamente utilizada para examinar processos em sistemas vivos devido à sua velocidade de aquisição rápida e compatibilidade com muitas amostras biológicas.
Químicos do Instituto de Biomoléculas Transformativas (ITbM) da Universidade de Nagoya desenvolveram um novo corante fluorescente fotoestável, PhoxBright 430 (PB430), que permite a imagem STED de super-resolução contínua de células marcadas com fluorescência. Como PB430 contém uma fração funcional para permitir a conjugação com um anticorpo, alvos específicos de biomoléculas dentro de uma célula podem ser corados por imunofluorescência. A fotoestabilidade excepcional de PB430 permitiu aos pesquisadores construir uma imagem STED 3-D de microtúbulos celulares e obter imagens STED multicoloridas de citoesqueletos fluorescentes marcados imunologicamente combinando PB430 fotoestável e corantes disponíveis comercialmente.
As propriedades exclusivas do PB430 o tornam uma ferramenta poderosa para revelar as estruturas e funções das células, e poderia ser aplicado à visualização prolongada do movimento de organelas e moléculas dentro das células. Os resultados deste estudo foram relatados recentemente no Jornal da American Chemical Society .
A fim de alcançar alta resolução em microscopia STED, uma amostra biológica marcada com um fluoróforo (um corante fluorescente usado para marcar amostras biológicas, como proteínas, tecidos e células) é irradiado com um feixe de excitação de fluorescência juntamente com um feixe STED em forma de donut para suprimir a excitação das moléculas circundantes. Embora seja uma técnica poderosa, a necessidade de um feixe STED de alta intensidade, que causa fotobranqueamento de corantes, inibiu o uso prático da microscopia STED em imagens de células vivas contínuas.
Os pesquisadores relataram anteriormente um corante fluorescente, C-Naphox, que exibe forte fotoestabilidade na imagem STED. O grupo agora otimizou a estrutura do C-Naphox e desenvolveu o novo corante fluorescente fotoestável, que pode ser usado para a visualização de estruturas dentro das células.
PB430 mostra fotoestabilidade excepcional em comparação com corantes convencionais, conforme mostrado no número de imagens confocais que podem ser obtidas sem perder sua intensidade de fluorescência relativa. O novo corante também pode marcar proteínas, como anticorpos e é capaz de escanear a célula ao longo do eixo z com uma etapa de 50 nm, resultando na reconstrução da imagem 3D-STED do citoesqueleto com resolução do eixo z de 160 nm. Crédito:ITbM, Universidade de Nagoya
"C-Naphox demonstrou ser um corante extremamente fotoestável para a imagem STED de vários materiais, então decidimos ajustar ainda mais suas propriedades e aplicá-las para visualizar ultraestruturas, "diz Masayasu Taki, professora associada do ITbM e uma das lideranças desta pesquisa. "Nosso novo corante, PB430 mostra maior solubilidade em água, fluoresce de forma eficiente em meio aquoso, e é capaz de marcar anticorpos. Ficamos satisfeitos em observar que ele também exibe alta fotoestabilidade sob condições STED, "diz Taki.
Chenguang Wang, um pesquisador de pós-doutorado no grupo de pesquisa do professor Shigehiro Yamaguchi na ITbM, PB430 sintetizado e realizado os experimentos de imagem STED. De maneira semelhante a C-Naphox, o novo corante fluorescente é estável ao ar e consiste em um material estruturalmente reforçado, anel fundido, Esqueleto conjugado a π que contém uma unidade de óxido P de fosfolo, qual é a origem do nome PhoxBright. Em vez da porção trifenilamina, PB430 tem um grupo de ácido carboxílico que pode se conjugar com anticorpos para marcação imunológica através da formação de um éster N-hidroxilsuccinimidil (NHS).
Os experimentos de imagem STED de anticorpos conjugados com PB430 em células HeLa fixas levaram a imagens de fluorescência de microtúbulos marcados imunologicamente, com apenas leve fotodegradação. PB430 agiu como um marcador fluorescente para proteínas e sua intensidade de fluorescência foi mantida mesmo quando foi conjugado.
"A alta fotoestabilidade do PB430 permite imagens de fluorescência que não eram facilmente possíveis com os corantes convencionais, "explica Taki." Por exemplo, PB430 pode ser usado em imagens 3-D-STED do citoesqueleto, porque ele pode suportar o feixe STED contínuo no eixo z após a geração de imagens no eixo xy. "
Além disso, o grupo mostrou que PB430 poderia ser aplicado a imagens STED multicoloridas, aproveitando a diferença na fotoestabilidade entre vários corantes fluorescentes. Eles realizaram experimentos de imagem STED de microtúbulos e vimentina (proteínas de filamento intermediário) do citoesqueleto, imunomarcado com PB430 e Alexa Fluor 430 (um corante fluorescente), respectivamente. Como Alexa Fluor 430 fotobleaches após tirar a primeira imagem STED, a segunda imagem mostra apenas microtúbulos marcados com PB430. Subtrair a primeira imagem da segunda imagem revela os filamentos de vimentina marcados com Alexa Fluor 430.
"Usualmente, a imagem STED multicolorida requer vários lasers de excitação e um único feixe de laser STED, mas na combinação de Alexa Fluor 430 com PB430, precisamos apenas de um único par de lasers de excitação e STED, "explica Taki." Ao usar PB430, acreditamos que será possível realizar imagens STED multicoloridas com várias combinações diferentes de vários corantes fluorescentes. A próxima etapa é melhorar a permeabilidade da membrana celular do corante, a fim de visualizar as funções de muitas outras estruturas celulares, " ele continua.
"Nossa pesquisa mostrou que a forte fotoestabilidade e compatibilidade fisiológica do PB430 permite imagens repetidas, bem como imagens 3-D e imagens multicoloridas de células por microscopia STED, "diz Yamaguchi." Esperamos poder aplicar nosso corante fluorescente para imagens de células vivas prolongadas por microscopia STED e microscopia de molécula única, a fim de examinar vários processos biológicos. "
