Os pesquisadores do MIT desenvolveram uma maneira de fazer imagens de alta resolução de amostras de tecido, por uma fração do custo de outras técnicas que oferecem resolução semelhante.

A nova técnica depende da expansão do tecido antes de obter imagens com um microscópio de luz convencional. Dois anos atrás, a equipe do MIT mostrou que era possível expandir os volumes de tecido 100 vezes, resultando em uma resolução de imagem de cerca de 60 nanômetros. Agora, os pesquisadores mostraram que expandir o tecido uma segunda vez antes da imagem pode aumentar a resolução para cerca de 25 nanômetros.

Este nível de resolução permite que os cientistas vejam, por exemplo, as proteínas que se agrupam em padrões complexos nas sinapses cerebrais, ajudando os neurônios a se comunicarem uns com os outros. Também pode ajudar os pesquisadores a mapear os circuitos neurais, diz Ed Boyden, professor associado de engenharia biológica e ciências do cérebro e cognitivas no MIT.

"Queremos ser capazes de rastrear a fiação de circuitos cerebrais completos, "diz Boyden, o autor sênior do estudo. "Se você pudesse reconstruir um circuito cerebral completo, talvez você pudesse fazer um modelo computacional de como ele gera fenômenos complexos como decisões e emoções. Uma vez que você pode mapear as biomoléculas que geram pulsos elétricos dentro das células e que trocam substâncias químicas entre as células, você poderia modelar potencialmente a dinâmica do cérebro. "

Essa abordagem também pode ser usada para criar imagens de outros fenômenos, como as interações entre as células cancerosas e as células do sistema imunológico, para detectar patógenos sem equipamentos caros, e mapear os tipos de células do corpo.

O ex-pós-doutorado do MIT Jae-Byum Chang é o primeiro autor do artigo, que aparece na edição de 17 de abril da Métodos da Natureza .

Expansão dupla

Para expandir as amostras de tecido, os pesquisadores os incorporam em um ambiente denso, gel gerado uniformemente feito de poliacrilato, um material muito absorvente que também é usado em fraldas. Antes que o gel seja formado, os pesquisadores rotulam as proteínas celulares que desejam obter imagem, usando anticorpos que se ligam a alvos específicos. Esses anticorpos carregam "códigos de barras" feitos de DNA, que, por sua vez, estão ligados a moléculas de reticulação que se ligam aos polímeros que constituem o gel expansível. Os pesquisadores então quebram as proteínas que normalmente mantêm o tecido unido, permitindo que os códigos de barras do DNA se expandam um do outro conforme o gel incha.

Essas amostras aumentadas podem então ser marcadas com sondas fluorescentes que ligam os códigos de barras do DNA, e imagens com microscópios confocais disponíveis comercialmente, cuja resolução é geralmente limitada a centenas de nanômetros.

Usando essa abordagem, os pesquisadores eram capazes de atingir uma resolução de cerca de 60 nanômetros. Contudo, "biomoléculas individuais são muito menores do que isso, digamos 5 nanômetros ou ainda menor, "Boyden diz." As versões originais da microscopia de expansão eram úteis para muitas questões científicas, mas não podiam igualar o desempenho dos métodos de imagem de alta resolução, como a microscopia eletrônica. "

Em seu estudo de microscopia de expansão original, os pesquisadores descobriram que poderiam expandir o tecido mais de 100 vezes em volume, reduzindo o número de moléculas de reticulação que mantêm o polímero em um padrão ordenado. Contudo, isso tornou o tecido instável.

"Se você reduzir a densidade do reticulador, os polímeros não retêm mais sua organização durante o processo de expansão, "diz Boyden, que é membro do Media Lab do MIT e do McGovern Institute for Brain Research. "Você perde a informação."

Em vez de, em seu último estudo, os pesquisadores modificaram sua técnica para que, após a primeira expansão do tecido, eles podem criar um novo gel que incha o tecido uma segunda vez - uma abordagem que eles chamam de "expansão iterativa".

Circuitos de mapeamento

Usando a expansão iterativa, os pesquisadores conseguiram imagens de tecidos com resolução de cerca de 25 nanômetros, que é semelhante ao alcançado por técnicas de alta resolução, como microscopia óptica de reconstrução estocástica (STORM). Contudo, a microscopia de expansão é muito mais barata e simples de realizar porque nenhum equipamento especializado ou produtos químicos são necessários, Boyden diz. O método também é muito mais rápido e, portanto, compatível com grande escala, Imagem 3-D.

A resolução da microscopia de expansão ainda não corresponde à da microscopia eletrônica de varredura (cerca de 5 nanômetros) ou da microscopia eletrônica de transmissão (cerca de 1 nanômetro). Contudo, microscópios eletrônicos são muito caros e não estão amplamente disponíveis, e com aqueles microscópios, é difícil para os pesquisadores rotular proteínas específicas.

No Métodos da Natureza papel, a equipe do MIT usou a expansão iterativa para imagens de sinapses - as conexões entre neurônios que permitem que eles se comuniquem entre si. Em seu estudo de microscopia de expansão original, os pesquisadores foram capazes de criar imagens de proteínas de andaime, que ajudam a organizar as centenas de outras proteínas encontradas nas sinapses. Com o novo, resolução aprimorada, os pesquisadores também puderam ver estruturas em escala mais precisa, como a localização dos receptores de neurotransmissores localizados nas superfícies das células "pós-sinápticas" no lado receptor da sinapse.

"Minha esperança é que possamos, nos próximos anos, realmente começar a mapear a organização dessas proteínas de arcabouço e sinalização na sinapse, "Boyden diz.

Combinar a microscopia de expansão com uma nova ferramenta chamada multiplexação temporal deve ajudar a conseguir isso, ele acredita. Atualmente, apenas um número limitado de sondas coloridas pode ser usado para obter imagens de moléculas diferentes em uma amostra de tecido. Com multiplexação temporal, os pesquisadores podem rotular uma molécula com uma sonda fluorescente, tire uma imagem, e, em seguida, lave a sonda. Isso pode ser repetido muitas vezes, cada vez usando as mesmas cores para rotular moléculas diferentes.

"Ao combinar a expansão iterativa com a multiplexação temporal, poderíamos, em princípio, ter essencialmente cores infinitas, imagens de resolução em nanoescala em grandes volumes 3-D, "Boyden diz." As coisas estão ficando realmente empolgantes agora que essas diferentes tecnologias podem se conectar em breve. "

Os pesquisadores também esperam alcançar uma terceira rodada de expansão, que eles acreditam que poderia, em princípio, permitir resolução de cerca de 5 nanômetros. Contudo, agora, a resolução é limitada pelo tamanho dos anticorpos usados ​​para marcar as moléculas na célula. Esses anticorpos têm cerca de 10 a 20 nanômetros de comprimento, para obter resolução abaixo disso, os pesquisadores precisariam criar marcadores menores ou expandir as proteínas umas das outras primeiro e, em seguida, entregar os anticorpos após a expansão.