Sondando interações entre moléculas pequenas e RNA observando a FLORESTA

Crédito:Química das Comunicações (2024). DOI:10.1038/s42004-024-01181-8

Uma equipe de pesquisadores demonstrou recentemente a utilidade de empregar um sistema de triagem previamente estabelecido para sondar as interações entre pequenas moléculas e RNA. O estudo deles foi publicado em Communications Chemistry .

A equipe foi liderada pelo Professor Hirohide Saito (Departamento de Fronteiras de Ciências da Vida, CiRA), Dr. Kaoru R. Komatsu (ex-aluno de doutorado no CiRA), Professor Associado Kazumitsu Onizuka e Professor Fumi Nagatsugi (Instituto de Pesquisa Multidisciplinar para Materiais Avançados, Universidade de Tohoku).

Desde as recentes vacinas de mRNA do SARS-CoV-2 para combater a pandemia de COVID-19 até o risdiplam, um modificador de splicing de RNA aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA para atrofia muscular espinhal, a palavra "RNA" entrou na linguagem comum, pois representa ambos novas classes de agentes terapêuticos e alvos de medicamentos.

No entanto, a nossa compreensão de como várias sequências de RNA e, por sua vez, estruturas ditam interações com moléculas pequenas, como compostos medicamentosos ou grandes biomoléculas, como proteínas, permanece incompleta.

Em um estudo anterior, o professor Saito e sua equipe de pesquisa projetaram um sistema chamado perfil de elemento de RNA dobrado com biblioteca de estrutura, ou FOREST, para examinar os detalhes moleculares de como o RNA interage com proteínas conhecidas de ligação ao RNA.

Para este novo estudo, através de uma colaboração com investigadores da Universidade de Tohoku, a equipa de investigação conjunta ilustrou como o FOREST pode ser utilizado para analisar pequenas interações moleculares com o ARN.

A equipe de pesquisa primeiro validou a aplicabilidade da abordagem FOREST para moléculas pequenas, examinando como uma biblioteca de estrutura de RNA interage com pequenos interatores de RNA moleculares conhecidos:derivados de G-clamp e laranja de tiazina (TO).

Os pesquisadores isolaram estruturas de RNA ligadas ao G-clamp de uma biblioteca que compreende mais de 1.800 sequências de RNA derivadas de pré-miRNAs humanos e outras sequências repetitivas e de controle. Como essas estruturas de RNA estão ligadas a um corante fluorescente e a um código de barras de RNA, elas podem ser prontamente decodificadas e quantificadas por um microarranjo de DNA com sequências complementares aos códigos de barras de RNA para fornecer uma análise quantitativa de como as estruturas de RNA interagem com a pequena molécula específica de interesse.

Como esperado, eles identificaram ligação preferencial a sequências de RNA de fita simples e dupla contendo guanosina (G) (ssRNA e dsRNA, respectivamente) por G-clamp. A partir da biblioteca de estrutura de RNA, a equipe de pesquisa escolheu sequências que mostram ligação de alta, intermediária ou baixa afinidade ao grampo G para validação por um experimento independente baseado em fluorescência que mede diretamente constantes de dissociação aparentes de interações individuais.

Notavelmente, eles observaram uma boa correlação entre a afinidade de ligação relativa estimada pela abordagem FOREST e as constantes de dissociação aparentes determinadas pelo ensaio de ligação baseado em fluorescência, indicando a alta robustez deste método para quantificar interações entre moléculas pequenas e RNA.

Além disso, ao mutar uma estrutura específica de alça de RNA com múltiplas guanosinas em locais diferentes, eles descobriram que o G-clamp não interage igualmente com todas as guanosinas na alça, mas que o contexto estrutural adicional pode influenciar a interação.

Por outro lado, os derivados TO são sondas comumente usadas para ensaios de deslocamento de indicador fluorescente (FID). Em seguida, os pesquisadores misturaram TO e TO-3 separadamente com uma biblioteca expandida de estrutura de RNA contendo sequências adicionais derivadas de RNAs do vírus SARS-CoV-2 e influenza A para caracterizar melhor os derivados de TO para medições de RNA.

Como esperado, embora não houvesse correlação entre perfis de ligação de estruturas de RNA interagindo com grampo G e derivados TO, TO e TO-3 compartilhavam perfis de ligação semelhantes com algumas pequenas distinções.

Outras comparações entre TO-N₃ , TO-N₃ -2 e TO-3-N₃ revelaram que a posição do ligante tem uma influência modesta sobre os perfis de ligação ao RNA. Além disso, com base nesses perfis de ligação, os pesquisadores discerniram algumas preferências posicionais de base e loop que os derivados TO têm ao interagir com estruturas de RNA.

A equipe de pesquisa estendeu adicionalmente sua análise de derivados TO comparando afinidades de ligação relativas determinadas pelo FOREST com as constantes de dissociação aparente medidas para indicadores nucleicos fluorescentes disponíveis comercialmente, TO-PRO-1 e TO-PRO-3, pelo ensaio de ligação baseado em fluorescência .

Através desta análise, eles revelaram que embora TO-N₃ -2 pode retratar com mais precisão o perfil de ligação de TO-PRO1 em comparação com TO-3-N₃ , ambos TO-N₃ -2 e TO-3-N₃ simula TO-PRO-3 igualmente bem, fornecendo assim insights estruturais cruciais para melhorar os pares de RNA alvo e indicadores fluorescentes para ensaios FID.

Usando os perfis de ligação determinados para derivados TO, a equipe de pesquisa selecionou combinações de indicadores fluorescentes (TO-PRO-1 ou TO-PRO-3) e sequências de pré-miRNA previamente demonstradas como desreguladas em tumores com afinidades de ligação intermediárias para ensaios FID.

Como prova de conceito, os pesquisadores examinaram uma biblioteca química disponível comercialmente com 118 compostos para identificar pequenas moléculas capazes de interagir com pré-miRNAs associados a doenças. Através deste esforço, eles identificaram baicaleína (Bai), miricetina (Myr), cloreto de queleritrina (Che) e AS 602801 (AS) como candidatos a compostos de sucesso. Embora Myr e Che sejam conhecidos por se ligarem a DNA e RNA, esta foi a primeira demonstração de AS como um interator de ácido nucleico.

Notavelmente, os pesquisadores observaram resultados diferentes quando TO-PRO-1 ou TO-PRO-3 foram usados como indicador fluorescente, sugerindo assim que indicadores distintos deveriam ser empregados para evitar identificações falsas positivas e negativas. Um exame mais aprofundado do AS confirmou a ligação a vários pré-miRNAs humanos de interesse, mas os pesquisadores também notaram que o composto exibia fortes propriedades de iluminação ao interagir com o RNA.

O exame estrutural do composto sugere que ele contém uma porção química provavelmente responsável pelas propriedades de iluminação, tornando-o um composto de interesse para desenvolvimento adicional em um novo interator de RNA e sonda fluorescente.

Neste estudo, o esforço conjunto de pesquisa ilustra mais uma vez a aplicabilidade da metodologia FOREST, não apenas para inspecionar interações RNA-proteína, mas também para investigar os detalhes das interações entre RNA e pequenas moléculas.

Dado o vasto potencial do ARN como uma nova abordagem terapêutica na medicina da próxima geração, a capacidade de caracterizar sistemicamente as interacções entre moléculas pequenas e ARN em larga escala terá enormes impactos na investigação básica do ARN e na tradução desse conhecimento em terapias.

Mais informações: Ryosuke Nagasawa et al, Análise em larga escala de interações entre moléculas pequenas e RNA usando bibliotecas de estrutura de RNA multiplexadas, Communications Chemistry (2024). DOI:10.1038/s42004-024-01181-8
Informações do diário: Química das Comunicações

Fornecido pela Universidade de Kyoto

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