Método de coloração negativa. (a) Os vírions estão ligados ao filme de suporte de carbono. (b) Uma solução contendo metais pesados (reagente de coloração negativa) é colocada no filme. (c) O excesso de solução é removido e a amostra é seca. (d) A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de vírions revestidos com metais pesados produz (e) uma imagem de contraste reverso do vírus. Crédito:Koichi Sahiro et al, Relatórios Científicos (2022). DOI:10.1038/s41598-022-11405-3
Ver é acreditar — ou, para os cientistas, o começo da compreensão. Os pesquisadores podem visualizar detalhes atomicamente pequenos com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) transmitindo elétrons através da amostra e capturando suas interações para formar uma imagem. Mas esses espécimes minúsculos podem escapar dos elétrons, então eles precisam ser especialmente tratados com metais pesados para garantir interações. Para ver vírus, por exemplo, o padrão atual é encharcar a amostra de vírus com uma solução contendo uma substância radioativa e rigidamente controlada chamada acetato de uranila.
As imagens resultantes são claras, mas o processo para adquirir e armazenar a solução de metal pesado radioativo necessária pode ser uma barreira complicada para os pesquisadores, de acordo com Masahiro Sadakane, professor de química aplicada na Escola de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia Avançada da Universidade de Hiroshima. Sadakane e sua equipe descobriram recentemente que um tratamento não radioativo pode produzir as mesmas imagens claras e detalhadas sem a confusão burocrática do acetato de uranila.
Eles publicaram suas descobertas em 12 de maio em
Relatórios Científicos .
“Observar a morfologia viral é essencial em virologia, para a qual o TEM é a técnica mais utilizada porque permite a visualização direta em escala nanométrica, mas atualmente requer reagentes de coloração negativa contendo elementos pesados”, disse Sadakane, autor correspondente do artigo. “Novos compostos não radioativos para observações simples, rápidas e claras usando TEM tradicional são necessários em todo o mundo”.
Uma alternativa comercialmente disponível atual para o acetato de uranila radioativo é um material conhecido como ácido fosfotúngstico "tipo Keggin". A molécula compreende uma unidade central de um fosfato e quatro oxigênios, fortemente cercados por tungstênio e mais oxigênio. Embora não seja radioativa, a molécula é altamente ácida e deve ser neutralizada antes do uso, segundo Sadakane. Ele também observou que as imagens que produz são menos nítidas do que as feitas com acetato de uranila. No entanto, apesar dessas desvantagens, o reagente pertence a uma grande família de compostos semelhantes – e possivelmente melhores.
"Estamos investigando compostos de fosfotungstato e relatamos anteriormente que o 'tipo Preyssler' pode ser usado como reagente de coloração negativa para observar uma estrutura fina de bactérias", disse Sadakane.
"As moléculas do tipo Preyssler também compreendem tungstênio, oxigênio e fosfato, mas são estruturalmente organizadas em torno de um íon encapsulado carregado positivamente, como sódio ou cálcio. Eles têm uma estrutura diferente dos compostos do tipo Keggin, resultando em uma molécula muito mais estável que é produzido como um sal de potássio."
Os pesquisadores aplicaram fosfotungstatos do tipo Preyssler para manchar e criar imagens de três tipos de vírus bacterianos (fagos) que infectam bactérias. As estruturas morfológicas desses fagos já estão bem documentadas e fornecem uma referência confiável para verificar a clareza das imagens obtidas em seu estudo.
"Nossos resultados indicam que os fosfotungstatos do tipo Preyssler são bons reagentes de coloração negativa para observações de vírus", disse Sadakane. "Eles são fáceis de usar, pois não são radioativos e não precisam de ajuste para os níveis de pH, além de fornecer imagens nítidas."
Os pesquisadores planejam aproveitar suas descobertas para desenvolver uma série de reagentes de coloração negativa não radioativos para observar outros vírus, bem como pequenas partículas orgânicas, como proteínas e muito mais, de acordo com Sadakane.
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