p Figura 1:(a) Esboço explicativo do nanossensor ancorado na membrana plasmática. Os compostos usados para a conjugação de nanopartículas de ouro (AuNP) são o éster pinacol 4-mercaptofenilborônico sensível a H2O2 (4MPBE) e a biotina-HPDP. A biotinilação dos ectodomínios da proteína da membrana plasmática é obtida usando NHS-Biotina. A ancoragem do AuNP conjugado e NHS-Biotina é dada pela Estreptavidina reagindo com as duas porções de biotina. (b) A análise de AFM foi realizada em células de câncer de pulmão A549 após ancoragem e fixação do nanosensor. Imagens de AFM de alta resolução confirmaram a presença do nanosensor, que está em contato com a superfície da célula e é capaz de detectar H2O2 endógeno em uma região muito rasa (isto é, 90 nm) do fluido extracelular em contato com a membrana plasmática. Crédito:Kanazawa University
p Pesquisadores da Universidade de Kanazawa relatam em
Biossensores e bioeletrônica um teste bem-sucedido de um sensor para medir as concentrações de peróxido de hidrogênio perto das membranas celulares. O sensor tem potencial para se tornar uma ferramenta para novas terapias contra o câncer. p Vários processos no corpo humano são regulados por reações bioquímicas envolvendo peróxido de hidrogênio (H
2 O
2 ) Embora possa atuar como um 'mensageiro secundário, "retransmitir ou amplificar certos sinais entre as células, H
2 O
2 geralmente é tóxico devido ao seu caráter oxidante. O último significa que converte (oxida) moléculas bioquímicas como proteínas e DNA. A propriedade oxidante de H
2 O
2 é de potencial relevância terapêutica para o câncer, embora:deliberadamente fazendo com que as células tumorais aumentem seu H
2 O
2 a concentração seria uma forma de destruí-los. Diante disso, mas também para monitorar patologias associadas a H
2 O
2 superprodução, é crucial ter um meio de quantificar com segurança as concentrações de peróxido de hidrogênio no ambiente extracelular. Agora, Leonardo Puppulin do Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), A Universidade de Kanazawa e seus colegas desenvolveram um sensor para medir as concentrações de H
2 O
2 na vizinhança das membranas celulares, com resolução nanométrica.
p O biossensor consiste em uma nanopartícula de ouro com moléculas orgânicas ligadas a ela. Todo o cluster é projetado para que se ancore facilmente na parte externa da membrana de uma célula, que é exatamente onde estão as moléculas de peróxido de hidrogênio a serem detectadas. Como moléculas de fixação, os cientistas usaram um composto chamado 4MPBE, conhecido por ter uma forte resposta de espalhamento Raman:quando irradiado por um laser, as moléculas consomem parte da energia do laser. Ao medir a mudança de frequência da luz laser, e traçar a intensidade do sinal em função dessa mudança, um espectro único é obtido - uma assinatura das moléculas 4MPBE. Quando uma molécula 4MPBE reage com um H
2 O
2 molécula, seu espectro Raman muda. Com base neste princípio, comparando espectros Raman, Puppulin e colegas conseguiram obter uma estimativa do H
2 O
2 concentração perto do biossensor.
p Figura 2:(a) Espectroscopia Raman intensificada por superfície foi usada para detectar e quantificar a modificação induzida por H2O2 de moléculas 4MPBE montadas na superfície de ouro do nanossensor ancorado às células. A intensidade da banda Raman em 998 cm-1 depende da concentração de H2O2, enquanto a banda em 1074 cm-1 não apresentou modificação e pode ser usada para normalização das linhas espectrais. (b) Resultados da calibração do nanosensor. A razão da intensidade em 1074 cm-1 para a intensidade em 998 cm-1 mostrou dependência linear em relação à concentração de H2O2. (C) Exemplo de mapa hiperespectral SERS de H2O2 endógeno extracelular coletado da superfície da célula A549 mostrado no imagem de campo claro. Os espectros SERS mostrados em (a) foram coletados dos locais A e B. Crédito:Kanazawa University
p Depois de desenvolver um procedimento de calibração para seu nanossensor - relacionando o H
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2 concentração para uma mudança no espectro Raman de forma quantitativa não é simples - os cientistas foram capazes de produzir um mapa de concentração com uma resolução de cerca de 700 nm para amostras de células de câncer de pulmão. Finalmente, eles também conseguiram estender sua técnica para obter medições do H
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2 variação da concentração através das membranas celulares.
p Puppulin e colegas concluem que sua "nova abordagem pode ser útil para o estudo do H real
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2 concentrações envolvidas na proliferação ou morte celular, que são fundamentais para elucidar totalmente os processos fisiológicos e desenhar novas estratégias terapêuticas. ”
p Figura 3:(a) Esquema explicativo da produção extracelular de H2O2 pelo complexo NOX, a conseqüente absorção pelo canal da Aquaporina e a reação com a peroxiredoxina intracelular. Na condição de estado estacionário, a razão da concentração de H2O2 extracelular para H2O2 intracelular pode ser estimada pela razão da constante de taxa de redução de H2O2 por peroxirredoxina (kprx) para a constante de taxa de absorção de H2O2 através da membrana plasmática (kabs). (b) - (c) Resultados típicos de experimentos de biologia redox com linhas de ajuste a partir das quais medimos kabs e kprx, respectivamente. (d) Superfície extracelular média [H2O2] e e o máximo típico de [H2O2] e medido em células A549 usando o nanosensor recém-projetado. (e) [H2O2] i médio intracelular e o máximo típico de [H2O2] i estimado em células A549 de acordo com o modelo relatado em (a) e usando os resultados de (b) - (d). Crédito:Kanazawa University
p O biossensor desenvolvido por Leonardo Puppulin da Universidade de Kanazawa e colegas é baseado em um método chamado espectroscopia Raman de superfície aprimorada (SERS). O princípio deriva da espectroscopia Raman, em que as diferenças entre as frequências de entrada e saída da luz laser irradiada em uma amostra são analisadas. O espectro obtido traçando a força do sinal em função da diferença de frequência é característico da amostra, que pode, em princípio, ser uma única molécula. Tipicamente, Contudo, o sinal vindo de uma molécula é muito fraco para detectar, mas o efeito pode ser aumentado quando a molécula é absorvida em uma superfície de metal áspera. Puppulin e colegas aplicaram a técnica para detectar (indiretamente) o peróxido de hidrogênio; sua molécula responsiva a Raman é um composto chamado 4MPBE, que é modificado quando exposto ao peróxido de hidrogênio.
