p Pesquisadores do Centro Brasileiro de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) criaram um fungo geneticamente modificado para produzir um coquetel de enzimas que decompõem os carboidratos da biomassa, como a palha da cana (copas e folhas) e o bagaço, em açúcar fermentável para conversão industrialmente eficiente em biocombustível. p O desenvolvimento de coquetéis enzimáticos de baixo custo é um dos principais desafios na produção do etanol de segunda geração.

p Os biocombustíveis de segunda geração são fabricados a partir de vários tipos de biomassa não alimentar, incluindo resíduos agrícolas, lascas de madeira e resíduos de óleo de cozinha. O processo do grupo de pesquisa CNPEM abre caminho para o aproveitamento otimizado dos resíduos da cana-de-açúcar para a produção de biocombustíveis.

p O fungo Trichoderma reesei é um dos mais prolíficos produtores de enzimas que degradam a parede celular de plantas e é amplamente utilizado na indústria de biotecnologia. Para aumentar sua produtividade como uma biofábrica para o coquetel de enzimas em questão, os pesquisadores introduziram seis modificações genéticas no RUT-C30, uma cepa do fungo publicamente disponível. Eles patentearam o processo e relataram em um artigo publicado na revista. Biotecnologia para biocombustíveis .

p “O fungo foi modificado racionalmente para maximizar a produção dessas enzimas de interesse biotecnológico. Usando a técnica de edição de genes CRISPR / Cas9, modificamos fatores de transcrição para regular a expressão de genes associados às enzimas, excluiu proteases que causaram problemas com a estabilidade do coquetel de enzimas, e acrescentou enzimas importantes que o fungo não possui na natureza. Como resultado, fomos capazes de permitir que o fungo produzisse uma grande quantidade de enzimas a partir de resíduos agroindustriais, uma matéria-prima barata e abundante no Brasil, "Mario T. Murakami, Diretor Científico do Laboratório de Biorrenováveis ​​do CNPEM (LNBR), disse à Agência FAPESP.

p Cerca de 633 milhões de toneladas de cana são processadas por safra no Brasil, gerando anualmente 70 milhões de toneladas métricas de palha de cana (massa seca), de acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB). Esse resíduo é subutilizado para a produção de etanol combustível.

p Murakami ressaltou que praticamente todas as enzimas usadas no Brasil para decompor a biomassa são importadas de alguns produtores estrangeiros que mantêm a tecnologia sob proteção de segredo comercial. Nesse contexto, o coquetel de enzimas importado pode representar até 50% do custo de produção de um biocombustível.

p "Sob o paradigma tradicional, décadas de estudos foram necessários para desenvolver uma plataforma competitiva de produção de coquetéis de enzimas, "disse ele." Além disso, os coquetéis não podiam ser obtidos apenas por técnicas de biologia sintética a partir de cepas disponíveis publicamente porque os produtores usaram métodos diferentes para desenvolvê-los, como a evolução adaptativa, expor o fungo a reagentes químicos, e induzir mutações genômicas para selecionar o fenótipo mais interessante. Agora, Contudo, graças a ferramentas avançadas de edição de genes, como CRISPR / Cas9, conseguimos estabelecer uma plataforma competitiva com apenas algumas modificações racionais em dois anos e meio. "

p O bioprocesso desenvolvido pelos pesquisadores do CNPEM produzia 80 gramas de enzimas por litro, o maior título experimentalmente suportado até agora relatado para T. reesei a partir de uma matéria-prima à base de açúcar de baixo custo. Isso é mais do que o dobro da concentração relatada anteriormente na literatura científica para o fungo (37 gramas por litro).

p "Um aspecto interessante desta pesquisa é que não se limitou ao laboratório, "Murakami disse." Testamos o bioprocesso em um ambiente de produção semi-industrial, ampliá-lo para uma planta piloto para avaliar sua viabilidade econômica. "

p Embora a plataforma tenha sido customizada para a produção de etanol celulósico a partir de resíduos da cana-de-açúcar, ele adicionou, pode quebrar outros tipos de biomassa, e açúcares avançados podem ser usados ​​para produzir outros biorenováveis, como plásticos e produtos químicos intermediários.

p Nova classe de enzimas

p O processo foi o resultado prático (em termos de aplicação industrial) de ampla pesquisa conduzida pelo LNBR para desenvolver enzimas capazes de quebrar carboidratos. Em outro estudo apoiado pela FAPESP e publicado em Nature Chemical Biology , os pesquisadores revelaram sete novas classes de enzimas presentes principalmente em fungos e bactérias.

p As novas enzimas pertencem à família da glicosídeo hidrolase (GH). De acordo com Murakami, essas enzimas têm potencial significativo para aplicações não apenas no campo dos biocombustíveis, mas também na medicina, processamento de alimentos e têxteis, por exemplo. As enzimas irão inspirar novos processos industriais ao alavancar as diferentes maneiras pelas quais a natureza decompõe polissacarídeos (carboidratos compostos de muitos açúcares simples).

p Essas enzimas quebram os beta-glucanos, alguns dos polissacarídeos mais abundantes encontrados nas paredes celulares dos cereais, bactérias e fungos, e uma grande fração da biomassa disponível no mundo, indicando o uso potencial das enzimas em conservantes de alimentos e têxteis. No caso dos biocombustíveis, a propriedade principal é sua capacidade de digerir material rico em fibras vegetais.

p “Nós nos propusemos a estudar a diversidade da natureza em polissacarídeos degradantes e como esse conhecimento pode ser aplicado a processos em diferentes indústrias, "Murakami disse." Além da descoberta de novas enzimas, outro aspecto importante desta pesquisa é a abordagem de rede de similaridade que usamos para produzir um conhecimento sistemático e profundo dessa família de enzimas. A abordagem nos permitiu começar do zero e em um tempo relativamente curto, chegam à família mais estudada de enzimas ativas em beta-1, 3-glucanos até o momento, com informações disponíveis sobre especificidade e mecanismos de ação. "

p O principal critério para classificar enzimas é geralmente a filogenia, ou seja, a história evolutiva da molécula, enquanto os pesquisadores do CNPEM se concentram na funcionalidade.

p "Graças aos avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, agora temos muitas sequências genéticas conhecidas e uma capacidade bem estabelecida para estudar e caracterizar moléculas e enzimas em termos de sua funcionalidade. Como resultado, fomos capazes de refinar a metodologia de rede de similaridade e usá-la pela primeira vez para estudar enzimas ativas em polissacarídeos, "Murakami disse.

p Usando a abordagem de rede de similaridade, o grupo classificou sete subfamílias das enzimas com base na funcionalidade. Caracterizando pelo menos um membro de cada subfamília, os pesquisadores acessaram em termos sistemáticos a diversidade de estratégias moleculares para degradar os beta-glucanos contidos em milhares de membros da família de enzimas.

p Tour de force bioquímico

p A análise filogenética se concentra em regiões de DNA que foram conservadas ao longo do tempo, enquanto a classificação por funcionalidade é baseada em regiões não conservadas associadas à diferenciação funcional. "Isso nos deu eficiência e nos permitiu agrupar mais de 1, 000 sequências em apenas sete subgrupos ou classes com a mesma função, "Murakami disse.

p Como a abordagem era nova, os pesquisadores realizaram vários outros estudos para verificar e validar o método de classificação. Dos sete grupos de enzimas capazes de degradar polissacarídeos, eles obtiveram 24 estruturas inteiramente novas, incluindo vários complexos substrato-enzima, considerado fundamental no fornecimento de informações que auxiliem no entendimento dos mecanismos de ação envolvidos.

p O estudo compreendeu análises funcionais e estruturais para entender como essas enzimas atuam sobre os carboidratos em questão. "Os polissacarídeos vêm em dezenas de configurações e são capazes de muitos tipos de ligações químicas, "Murakami disse." Queríamos observar exatamente quais ligações químicas e arquiteturas são reconhecidas por cada enzima. Por esta razão, tinha que ser um estudo multidisciplinar, combinando dados estruturais e funcionais suportados por análise usando espectrometria de massa, espectroscopia, experimentos de mutagênese e difração para elucidar a estrutura atômica. "

p Na seção "Notícias e Visualizações" da mesma edição de Nature Chemical Biology , Professor Paul Walton, Cadeira de Química Bioinorgânica da Universidade de York, no Reino Unido, classificou o estudo da glicosídeo hidrolase como um "tour de force 'bioquímico" por sua abordagem inovadora e elogiou seus "tremendos insights", acrescentando que os pesquisadores foram "capazes de expressar e isolar exemplares de cada classe [de enzimas] para examinar se as diferenças nas sequências entre as classes se refletiam em suas estruturas e atividades".