Zoë Fisher e Katarina Koruza do laboratório de suporte ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) e Lund University têm usado métodos de difusão de vapor para cultivar grandes cristais de proteína para técnicas de nêutrons como parte do pacote de trabalho de crescimento de cristal do SINE2020. Contudo, além de ser capaz de cultivar cristais grandes o suficiente para essas técnicas, eles também querem torná-los deuterados. As versões deuteradas permitem uma relação sinal-ruído melhorada, fundo incoerente reduzido e o uso de métodos de variação de contraste.

A equipe tentou fazer grandes cristais de várias proteínas, incluindo a proteína de membrana, timidina quinase de tomate (TOTK1) e superóxido dismutase (bSOD), que está presente em todos os organismos e está envolvida no processo de envelhecimento. Contudo, embora tenham conseguido cultivar bons cristais, eles simplesmente não eram grandes o suficiente - menos de 0,1 mm3.

Mas Zoë e Katarina tiveram muito mais sucesso com as proteínas anidrase carbônica humana (HCA). A proteína HCA IX, em particular, está implicada na metástase do câncer e surgiu como um possível alvo para a detecção do câncer, imagem, e tratamento. As técnicas de nêutrons podem fornecer detalhes sobre o sítio ativo - ligações de hidrogênio, organização da água, ligação de ligante - isso ajudaria no design de medicamentos contra o câncer aprimorados.

HCA II de tipo selvagem, HCA IX Mimic (onde parte da molécula de HCA II foi adaptada para imitar o sítio ativo da proteína HCA IX) e uma variante de superfície HCA IX (SV), que tem 6 mutações de superfície para torná-lo mais solúvel e estável, foram as proteínas escolhidas para o projeto. Quando não é eficiente fazer proteínas deuteradas, fazendo-as do zero ou comprando-as comercialmente, eles são deuterados por meio de troca H-D, onde são "embebidos" em uma solução deuterada (buffer). Para este trabalho, eles foram todos expressos em E. coli sob condições hidrogenadas e deuteradas para fazer versões H e D.

Eles então começaram a cristalizar as proteínas usando métodos de difusão de vapor para que os cristais pudessem ser estudados usando tanto raios-X quanto cristalografia de nêutrons.

Esta não foi uma tarefa fácil. As proteínas são muito sensíveis. Foi necessário usar configurações estáveis ​​por longos períodos de incubação e equilíbrio. A temperatura, taxas de evaporação, O pH e as concentrações de proteína e precipitante tiveram que ser cuidadosamente controlados usando poços de cristalização e controle automático, por exemplo, variando a temperatura para cima e para baixo conforme necessário.

Adicionalmente, a fim de fazer cristais grandes o suficiente para cristalografia de nêutrons, você precisa usar um grande volume de material inicial, normalmente 100-500 microlitros ou 100 s de mg. Esses grandes volumes significam que o crescimento do cristal é lento - portanto, as condições precisavam ser controladas por muitos meses de cada vez.

Infelizmente, os rendimentos de cristal obtidos para as versões deuteradas não foram tão bons quanto para as versões hidrogenadas, produzindo regularmente cristais cada vez menores. Foi descoberto que, para algumas proteínas deuteradas, não era possível usar as condições que funcionavam para as versões hidrogenadas e as condições precisavam ser otimizadas para o crescimento de cristais deuterados.

Mas com perseverança, Zoë e Katarina conseguiram fazer crescer um cristal de HCA (IX) SV acima de 1 mm3 e um cristal de 1,8 mm3 de imitação de HCA (IX). Eles agora foram capazes de obter resultados de raios-X e também resultados de nêutrons de LADI no ILL e iBIX no Japão.