Pela primeira vez, cientistas da Escola de Ciências Moleculares da ASU, em colaboração com colegas da Faculdade de Medicina Albert Einstein, na cidade de Nova York, capturaram instantâneos de estruturas cristalinas de intermediários na via bioquímica que nos permite respirar.

Publicado hoje no Proceedings of the National Academy of Sciences - Instantâneo de um intermediário de oxigênio na reação catalítica da citocromo c oxidase - seus resultados fornecem informações importantes sobre a etapa final da respiração aeróbica.

"É preciso uma equipe para conduzir um experimento tão sofisticado, "explica a professora associada da SMS Alexandra Ros que, junto com seu aluno de graduação Austin Echelmeier e o ex-estagiário Gerrit Brehm, desenvolveu o misturador de focalização hidrodinâmica que possibilitou esses experimentos.

O misturador é um dispositivo microfluídico, que é de alta resolução, 3-D-impresso e permite que dois fluxos de tampão saturado de oxigênio se misturem perfeitamente com um fluxo central contendo microcristais de citocromo c oxidase (bCcO) bovino. Isso inicia uma reação catalítica entre o oxigênio e os microcristais.

No início

Esta pesquisa foi instigada por uma conversa entre a professora da SMS Petra Fromme, diretor do Centro de Descoberta Estrutural Aplicada (CASD) do Biodesign Institute, Raimund Fromme, Professor associado de pesquisa de SMS, e o professor Denis Rousseau, do Albert Einstein College of Medicine da cidade de Nova York, que trabalha na estrutura do citocromo c oxidase, uma enzima chave envolvida com a respiração aeróbica.

A citocromo c oxidase (CcO) é a última enzima da cadeia respiratória de transporte de elétrons das células localizadas na membrana mitocondrial. Ele recebe um elétron de cada uma das quatro moléculas do citocromo c, e os transfere para uma molécula de oxigênio (dois átomos), converter o oxigênio molecular em duas moléculas de água.

Pesquisadores do CASD, incluindo o professor de física Richard Snell da ASU, John Spence, ajudou a criar uma nova técnica chamada cristalografia serial de femtosegundo resolvido com tempo (milionésimo de bilionésimo de segundo) (TR-SFX). Esta técnica tira proveito de um laser de elétrons livres de raios-X (XFEL) no Laboratório Nacional do Acelerador SLAC do Departamento de Energia (DOE), Stanford.

SFX é uma técnica promissora para determinação da estrutura de proteínas, onde um fluxo líquido contendo cristais de proteína é cruzado com um feixe XFEL de alta intensidade que é um bilhão de vezes mais brilhante do que as fontes tradicionais de raios-X síncrotron.

Enquanto os cristais difratam e imediatamente após são destruídos pelo intenso feixe XFEL, os padrões de difração resultantes podem ser registrados com detectores de última geração. Novos métodos de análise de dados poderosos foram desenvolvidos, permitindo que uma equipe analise esses padrões de difração e obtenha mapas de densidade de elétrons e informações estruturais detalhadas de proteínas.

O método é especificamente atraente para proteínas difíceis de cristalizar, como proteínas de membrana, uma vez que produz informações estruturais de alta resolução de pequenos micro ou nanocristais, reduzindo assim a contribuição de defeitos de cristal e evitando o crescimento tedioso (se não impossível) de grandes cristais, como é necessário na cristalografia tradicional baseada em síncrotron.

Este novo método de "difração antes da destruição" abriu novos caminhos para a determinação estrutural de biomoléculas frágeis sob condições fisiologicamente relevantes (em temperatura ambiente e na ausência de crioprotetores) e sem danos por radiação.

O CcO reduz o oxigênio a água e aproveita a energia química para conduzir a relocação do próton (átomo de hidrogênio com carga positiva) através da membrana mitocondrial interna por um mecanismo não resolvido anteriormente.

Resumindo, os estudos do TR-SFX permitiram a determinação estrutural de um oxigênio-chave intermediário do bCcO. Os resultados dos experimentos da equipe fornecem novos insights sobre o mecanismo de realocação de prótons na enzima da vaca, em comparação com os CcOs bacterianos, e abre caminho para a determinação das estruturas de outros intermediários CcO, bem como espécies transitórias formadas em outras reações enzimáticas.