Pesquisadores russos do Instituto de Física Geral Prokhorov da Academia Russa de Ciências (GPI RAS) e do Instituto de Física e Tecnologia de Moscou (MIPT) desenvolveram o primeiro método ultrassensível do mundo para detecção rápida de pequenas moléculas. Este método detecta traços de toxinas, hormônios, vitaminas e outras moléculas biologicamente ativas que são significativas para o monitoramento de saúde e segurança alimentar, entre outras aplicações possíveis. O estudo foi publicado na edição de novembro da Analytica Chimica Acta .

O novo ensaio de fluxo lateral depende de rótulos magnéticos e leva menos de 30 minutos. É 100 vezes mais sensível do que o ensaio de imunoabsorção enzimática, ou ELISA, usado para testes de laboratório convencionais. Os autores demonstraram a eficácia da nova abordagem em um modelo de ensaio que mede a tiroxina em soro de sangue humano. A tiroxina é um dos principais hormônios produzidos pela glândula tireóide e é útil para monitorar sua função. O procedimento de ensaio é acessível e simples o suficiente para ser realizado no local de atendimento, logo após a coleta de sangue.

A razão pela qual é necessário detectar compostos de moléculas pequenas com alta sensibilidade é que eles geralmente têm um forte efeito no corpo, mesmo em pequenas concentrações. Atualmente o ELISA é considerado o padrão ouro para medir a concentração de pequenas moléculas. Contudo, este método requer laboratórios adequadamente equipados com pessoal altamente qualificado para sua implementação. A sensibilidade da detecção do hormônio tireoidiano pode ser aumentada por meio de radioimunoensaios com marcadores radioativos que têm meia-vida curta, apesar de suas limitações significativas e são potencialmente perigosos. Outras análises convencionais requerem um longo preparo de amostras e equipamentos especializados.

O ensaio de fluxo lateral (LFA), amplamente conhecido por sua aplicação em testes de gravidez, representa uma alternativa atraente. Comparado com ELISA, é menos elaborado e tecnicamente complexo. Contudo, em muitos países, tem aprovação regulamentar para obter resultados de limiar apenas e apenas para aqueles casos para os quais a alta sensibilidade não é essencial. É, portanto, um objetivo principal em diagnósticos médicos desenvolver um método para a detecção de pequenas moléculas que seja rápido, confidencial, e simples.

No estudo relatado nesta história, uma equipe de pesquisa conjunta da GPI RAS e MIPT desenvolveu um kit de ensaio que usa um LFA modificado com nanolabels magnéticos e ligantes bifuncionais. Para testar as capacidades e limitações do novo sistema, os autores optaram por detectar tiroxina, o principal hormônio da glândula tireóide, como um modelo. Além disso, dotou suas pesquisas de significado clínico.

O layout do novo imunoensaio magnético difere do LFA convencional em vários aspectos (ver figura 1). O soro do sangue de um paciente, que é testado para tiroxina livre, é suplementado simultaneamente com anticorpos marcados com nanopartículas magnéticas e com um ligante de tiroxina bifuncional. Este ligante bifuncional é uma tiroxina covalentemente ligada à biotina por meio de uma "ponte" que conecta as duas moléculas, mas também as separa. Os anticorpos nas nanopartículas magnéticas podem se ligar tanto à tiroxina do soro sanguíneo quanto ao ligante bifuncional. Depois de um certo período de tempo, o suficiente para que as moléculas na solução se liguem umas às outras, a mistura é depositada em uma membrana. As partículas ligadas ao ligante bifuncional são capturadas na linha de teste da estreptavidina, uma proteína que possui uma afinidade extraordinariamente alta para a biotina. Para recuperar os resultados do ensaio, os pesquisadores usaram equipamento eletrônico original, que emprega o método de quantificação de partículas magnéticas ultrassensíveis, ou MPQ. Envolve a remagnetização de partículas não lineares por um campo magnético alternado em duas frequências e uma detecção subsequente da resposta indutiva em frequências combinatórias. Junto com a precisão do método MPQ, a alta afinidade do ligante bifuncional para a tira de teste garante uma sensibilidade sem precedentes do ensaio atingindo um limite de detecção de cerca de 1 milhão de moléculas do hormônio por mililitro (16 femtogramas!) com uma faixa dinâmica de três ordens.

Petr Nikitin, Ph.D., que liderou a equipe de pesquisa, compartilharam mais detalhes sobre o estudo:"Nossos métodos para medir a concentração de compostos de pequenas moléculas são realizados por meio de tiras imunocromatográficas universais com estreptavidina na linha de detecção. Portanto, eles são fáceis de replicar e aumentar. Para desenvolver testes para outros analitos, exigiríamos anticorpos padrão e ligantes bifuncionais especiais, cuja síntese para pequenas moléculas é um desafio. "

"Felizmente, nosso kit de ferramentas inclui técnicas interferométricas originais e equipamentos que desenvolvemos anteriormente, que permitem a detecção em tempo real da dinâmica de interação molecular, "explicou Petr Nikitin, graduado pelo MIPT em 1979 e chefe de um laboratório da GPI RAS. "Usamos este equipamento para identificar os imunorreagentes ideais e os ligantes bifuncionais tiroxina-biotina, que, por natureza de seu espaçamento, A estrutura "em ponte" torna ambas as moléculas pequenas disponíveis para uma interação eficaz com as duas moléculas grandes, ou seja, com o anticorpo de detecção e estreptavidina. Isso nos economizou muito tempo para o desenvolvimento de testes e contribuiu amplamente para o sucesso desta pesquisa. "

O principal autor do artigo, Alexey Orlov, Ph.D., um pesquisador do GPI RAS e do Laboratório de Nanobiotecnologia do MIPT, acrescentou:"Usamos partículas magnéticas como nanolabels de reações imunoquímicas. Um dispositivo portátil detecta quantitativamente essas partículas com alta precisão de registro de todo o volume da zona de reação 3-D em uma tira de teste, em vez da superfície de uma membrana, como acontece no caso de etiquetas ópticas. Este é um dos fatores que garantem a simplicidade de nossas medições de concentração ultrabaixa de pequenas moléculas em meios complexos. Como resultado, virtualmente qualquer um está equipado para realizar ensaios exclusivamente sensíveis sem preparação de amostra elaborada. "

"O novo ensaio é uma técnica de teste point-of-care cujas características superam consideravelmente os sistemas existentes para diagnósticos laboratoriais, "disse Sergey Znoyko, Ph.D., o primeiro autor do artigo. "No futuro, expandindo a gama de moléculas biológicas detectáveis ​​desta forma, seríamos capazes de realizar um ensaio multiparâmetro de meios complexos, como o sangue, que seria muito mais barato do que seus análogos atuais. "

"Essa abordagem é simples, acessível, e adaptável para a detecção de outras pequenas moléculas, "disse a estudante de pós-graduação do MIPT Natalia Guteneva, coautor do estudo. "Esperamos que seja ativamente usado para pesquisar novos marcadores de doenças, em diagnósticos médicos, monitoramento ecológico, controle de segurança alimentar, biossegurança, e em outros lugares. "