Pesquisadores do Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley Lab) e da University of California, Berkeley combinou microscopia crioeletrônica de ponta (crio-EM) com modelagem molecular computacional para produzir um modelo de resolução quase atômica da interação entre microtúbulos - componentes cruciais da ultraestrutura de células eucarióticas - e proteínas associadas a microtúbulos chamadas tau.

O modelo fornece uma visão sobre como a tau estabiliza os microtúbulos, e o que o faz se dissociar para formar agregados de tau, ou "emaranhados, "em algumas doenças neurológicas - incluindo a doença de Alzheimer - geralmente chamadas de tauopatias.

Os microtúbulos desempenham um papel importante na manutenção da forma celular, permitindo algumas formas de locomoção, facilitando o transporte intracelular, e segregar cromossomos durante a mitose. Cada microtúbulo é um cilindro oco composto por treze protofilamentos paralelos de proteína tubulina.

Tau ajuda a manter os microtúbulos estáveis ​​e os organiza em feixes. Mutações ou modificações pós-traducionais, como hiperfosforilação, que reduzem a afinidade da tau pelos microtúbulos, acredita-se que contribuam para a formação de emaranhados de tau.

O time, liderado por Eva Nogales, um cientista sênior do corpo docente da Divisão de Biofísica Molecular e Bioimagem Integrada (MBIB) no Berkeley Lab e um investigador do Howard Hughes Medical Institute e professor da UC Berkeley, usou crio-EM para criar imagens de tau adulta nativa de comprimento total ligada a microtúbulos com uma resolução geral de 4,1 A ?. Eles mostraram que a tau se liga longitudinalmente ao longo da crista dos filamentos de tubulina, um achado consistente com um estudo anterior de crio-EM de baixa resolução.

Tau é uma proteína intrinsecamente desordenada que inclui um domínio de projeção, uma região de ligação a microtúbulos de quatro repetições de sequência imperfeita, e um domínio C-terminal. A tubulina é um dímero, o que significa um par conjunto de polipeptídeos intimamente relacionados, neste caso α-tubulina e β-tubulina. Os dímeros de tubulina são enfileirados (ou polimerizam) da cabeça à cauda para formar os protofilamentos que compõem os microtúbulos.

"Dada a extensa literatura sobre sua falta de estrutura regular, não tínhamos certeza de que o tau realmente formaria interações ordenadas com a tubulina, "disse Elizabeth Kellogg, um pesquisador de pós-doutorado no laboratório de Nogales e co-primeiro autor no artigo que apresenta o trabalho, publicado em 10 de maio na revista Ciência .

Para testar hipóteses sobre quais resíduos de tau estão envolvidos na ligação à tubulina, eles então criaram construções de tau sintéticas com regiões de ligação de microtúbulos compostas por quatro repetições idênticas e também criaram imagens daquelas anexadas aos microtúbulos (resolução geral de 3,2-3,9 Å). Simon Poepsel, um pesquisador de pós-doutorado no laboratório de Nogales, havia trabalhado com a forma amilóide de tau como estudante de graduação e foi fundamental na purificação e preparação das amostras para crio-EM.

"Quando finalmente pudemos ver o comprimento de uma repetição tau e ver que ela tinha uma estrutura definida e local de ligação, percebemos que a tau estava de fato formando interações específicas com a superfície da tubulina, "Kellogg disse." Quando fomos capazes de reconciliar isso com a duração de uma repetição e as informações de sequência que tínhamos, era a chave de que precisávamos para descobrir como melhorar as reconstruções o suficiente para permitir a modelagem atômica. "

A equipe então se voltou para Rosetta, um conjunto abrangente de ferramentas de modelagem computacional para prever as estruturas atômicas tridimensionais de macromoléculas a partir de informações de sequência de aminoácidos, com base na conformação com o estado de energia mais baixo. Os mapas crio-EM de alta resolução permitiram à equipe colocar restrições na forma geral do complexo molecular, aumentando a fidelidade do modelo, Nogales explicou.

Frank DiMaio, professor associado do departamento de bioquímica e do Institute for Protein Design da University of Washington, contribuiu com sua experiência trabalhando com a plataforma Rosetta, particularmente a função "ajuste à densidade" usando dados crio-EM.

Rosetta structure predictions for two different synthetic tau constructs converged on the same solution:a backbone stretch of 27 residues spanning three tubulin monomers. "The identical sequence register and atomic details from two independent maps underscores the robustness of our solution and provides high confidence in the accuracy of our atomic models, " Nogales said.

"Our structure shows how tau's main contact with the microtubule surface is at the interface between tubulin subunits, serving as a 'stapler' to promote the association between tubulin subunits and explaining how tau promotes microtubule stability, " said Kellogg. "The structure also explains how tau phosphorylation leads to its dissociation from microtubules."

Phosphorylation of the serine at position 262 (universally conserved among tau repeats) has been observed to attenuate microtubule binding and is a marker of Alzheimer's disease. The model shows that phosphorylation at this crucial anchor point would disrupt interaction between tau and the microtubule and thus cause the "staples to fall off". Additional residues that are critical for tau-microtubule binding were identified as well.