p O diagnóstico molecular desempenha um papel cada vez mais importante na medicina para a detecção de doenças genéticas, o monitoramento da eficácia da terapia anticâncer, e na luta contra infecções bacterianas agressivas. Curiosity Diagnostics (CD), uma empresa pertencente ao grupo Scope Fluidics, desenvolveu uma nova técnica para análise de DNA:PCR sinérgica (sPCR). O método, descrito em detalhes na publicação conjunta de pesquisadores do CD e IPC PAS em Relatórios Científicos combina as vantagens de duas das técnicas de análise de código genético mais populares da atualidade e pode ser executada em instrumentos amplamente disponíveis. p "A técnica de ensaio de DNA que propomos nasceu durante o desenvolvimento do inovador instrumento analítico PCR | ONE, que pode ser usado para testar o código genético em apenas sete minutos. Este é um tempo mais de dez vezes menor do que o exigido em soluções clássicas, "diz o Prof. Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

p As amostras encaminhadas para testes de DNA geralmente contêm tão pouco material genético que sua análise por técnicas convencionais de laboratório não seria possível. Depois de eliminar as impurezas da amostra, o primeiro passo é aumentar a quantidade de material genético, frequentemente em até um bilhão de vezes. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para esse propósito.

p A reação de PCR envolve o aquecimento e resfriamento cíclicos de uma solução contendo o material genético sendo amplificado e os reagentes apropriados:uma polimerase (ou seja, a enzima que catalisa a reação de síntese de DNA), os nucleotídeos necessários para construir a fita de DNA, e primers, ou seja, fragmentos curtos de DNA capazes de se ligar ao início e ao final do fragmento de código propagado (por exemplo, um gene específico). Cada ciclo de PCR consiste em fases de aquecimento e resfriamento. Na primeira fase, a uma temperatura de cerca de 95 graus centígrados, as pontes de hidrogênio quebram, e a cadeia de DNA de fita dupla até então se divide em duas fitas simples. Na fase legal, a uma temperatura de cerca de 50 graus, os primers da solução se ligam aos locais correspondentes nas roscas, após o que a polimerase constrói um fio complementar entre eles. No final de cada ciclo, existem (em condições ideais) duas vezes mais fragmentos de DNA de fita dupla do que no início.

p O PCR é usado para detectar fragmentos específicos do código genético e estimar a quantidade original de material genético. As medições quantitativas são geralmente realizadas usando uma técnica analógica conhecida como PCR em tempo real. A amostra é propagada, e em ciclos subsequentes, a quantidade de DNA é verificada usando corantes fluorescentes. Quando a intensidade das mudanças excede um limite definido, a quantidade original de material genético é estimada com base no número de ciclos. A técnica de PCR analógico é relativamente simples, mas devido à sensibilidade do PCR até mesmo a partículas únicas de impurezas, requer cuidado, calibração contínua.

p Outro método é o PCR digital. A amostra é dividida em dezenas ou centenas de milhares, e às vezes até milhões de partições de volume igual. Então, em cada partição, realiza-se o procedimento de duplicação do material genético e verifica-se se aparece a alteração do conjunto. Durante a divisão da amostra de DNA, moléculas alcançam apenas algumas partições, portanto, a mudança não ocorre em todos os lugares. A quantidade original de DNA pode, portanto, ser estimada com base no número de sinais registrados. A vantagem da tecnologia digital é que não há necessidade de calibrar o dispositivo. Contudo, devido à necessidade de conduzir um grande número de reações em paralelo, o equipamento de teste é caro e não é tão comum em laboratórios quanto o aparelho de PCR analógico.

p PCR sinérgico, a técnica proposta por CD e IPC PAS, combina as vantagens mais importantes dos métodos analógico e digital. Para obter medições confiáveis, é o suficiente para diluir uma amostra em apenas uma dúzia, ou no máximo várias dezenas de partições. Este método não requer calibração.

p "Um pequeno número de partições, característica de nossa técnica, tem um significado prático específico. Isso significa que, para realizar a análise, tudo o que é necessário é o formato de placa de poço padrão usado em dispositivos de PCR analógicos populares, "diz Pawel Debski, um aluno de PhD do IPC PAS, que desenvolveu o método sPCR na Curiosity Diagnostics.

p Devido a um pequeno número de partições de amostra, a técnica sPCR é mais fácil de executar e um pouco mais rápida do que as variantes digitais. Em comparação com as técnicas analógicas, Contudo, mais reagentes são necessários. Por esta razão, não substituirá a variante analógica, de acordo com os cientistas. Contudo, pode ser uma adição valiosa porque não precisa de calibração, permitindo assim que a equipe do laboratório verifique a exatidão das medições analógicas de forma independente.

p "Nossa técnica de teste de DNA foi patenteada. No entanto, queremos enfatizar a liberdade de usá-lo para fins não comerciais. E uma vez que usa o típico, equipamento de teste genético popular, tudo que você precisa fazer para começar é acessar nosso artigo, "destaca o Prof. Garstecki.

p Em máquinas PCR padrão, difusão de calor relativamente lenta entre a amostra e um grande bloco adjacente de material alternadamente aquecido ou resfriado é usada para aquecer e resfriar o material genético. Em PCR | ONE, radiação infravermelha é usada para aquecer a amostra rapidamente. O mecanismo de resfriamento por difusão também foi modificado:o bloco utilizado para esta finalidade é menor do que nos instrumentos convencionais e é mantido constante, temperatura estritamente controlada. Como resultado das melhorias técnicas e analíticas, os protótipos do PCR | ONE são capazes de completar os ensaios de DNA em menos de um quarto de hora, e o próprio PCR leva apenas sete minutos. Os primeiros dispositivos PCR | ONE chegarão ao mercado provavelmente em dois a três anos.