Nova ferramenta de sequenciamento de nanoporos unicelulares acelera a análise de células tumorais
Diagramas esquemáticos dos fluxos de trabalho scNanoRNAseq e scNanoGPS. a, Fluxo de trabalho experimental e estrutura de biblioteca de scNanoRNAseq. b, Fluxo de trabalho computacional do scNanoGPS. Investigadores da Northwestern Medicine liderados por Ruli Gao, Ph.D., professor assistente de Bioquímica e Genética Molecular, desenvolveram uma nova ferramenta de sequenciamento genético que acelera a análise de sequenciamento de genótipos e fenótipos de mesmas células em tumores, conforme detalhado em um estudo publicado em Comunicações da Natureza .
O sequenciamento de RNA nanoporo unicelular é um tipo mais recente de sequenciamento genético que impulsiona as atuais técnicas de sequenciamento de RNA unicelular de alto rendimento do sequenciamento de próxima geração (NGS), que só pode sequenciar cadeias curtas de RNAs, para leitura longa de terceiros. sequenciamento de geração (TGS), que pode medir diretamente o comprimento total dos RNAs.
No entanto, a técnica avançada também é conhecida por produzir altos erros de sequenciamento e também depende de sequenciamento de leituras curtas – gerando dados NGS correspondentes para orientar a identificação de dados celulares – ou do uso de uma lista de permissões de código de barras para dividir os dados em células verdadeiras e únicas. moléculas.
"Esta técnica depende de códigos de barras de células e códigos de barras de moléculas únicas, o que chamamos de identificadores de moléculas únicas, para alcançar alto rendimento, então você vê os desafios devido a maiores erros de sequenciamento em sequências de códigos de barras. Os métodos atualmente disponíveis dependem de dados de próxima geração ou dependem de uma lista de permissões teórica para reconhecer quais são os verdadeiros códigos de barras celulares e os identificadores únicos de moléculas", disse Gao, que também é membro do Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center da Northwestern University.
Para melhorar esse processo, a equipe de Gao desenvolveu o scNanoGPS (análise de sequenciamento Nanopore de célula única de genótipos e fenótipos simultaneamente), uma nova ferramenta de sequenciamento que realiza desconvolução completamente independente de leituras longas propensas a erros em células e moléculas únicas.
"Para facilitar ainda mais as aplicações de novas tecnologias na pesquisa genômica, o scNanoGPS constrói módulos funcionais adicionais para calcular genótipos (mutações) e fenótipos (expressões de genes e isoformas) em células individuais a partir de dados de sequenciamento de RNA de nanoporos unicelulares de alto rendimento", disse Cheng-Kai Shiau, Ph.D., pós-doutorado no laboratório Gao e co-autor do estudo.
O scNanoGPS aumenta o rendimento de sequenciamento de centenas para milhares de células, o que é comparável às atuais técnicas de sequenciamento de RNA unicelular baseadas em leituras curtas amplamente aplicadas, e os perfis de expressão entre dados de leitura curta e de leitura longa são altamente concordantes, de acordo com Gao.
"Devido à cobertura de todo o corpo genético, os dados de leitura longa permitem cálculos de isoformas de splicing e alterações genéticas que são amplamente ignoradas pelo sequenciamento de RNA unicelular de leitura curta", disse Gao.
Para validar sua ferramenta, a equipe de Gao usou o scNanoGPS para sequenciar células tumorais renais e linfócitos, descobrindo que as células expressam combinações específicas de isoformas e mutações genéticas do tipo celular.
"Encontramos isoformas específicas de tipos de células, incluindo isoformas específicas de células tumorais e isoformas específicas de células imunológicas, e também demonstramos perfis de mutação específicas de tipos de células dentro dos mesmos tumores", disse Lina Lu, Ph.D., pós-doutoranda no Laboratório Gao e coautor do estudo.
"Sabe-se que as isoformas de splicing alternativo são um mecanismo pós-transcrição crítico para aumentar a complexidade das proteínas nas células humanas. Estamos entusiasmados em observar que o scNanoGPS permite a medição direta de isoformas de splicing em níveis unicelulares", disse Gao.
Quanto a aplicações futuras, Gao espera que o scNanoGPS possa ser usado para identificar isoformas específicas de tipos de células que contribuem para diversas doenças humanas, como câncer, insuficiência cardíaca e até mesmo rejeição de transplantes de órgãos.
"Novas tecnologias tornam a geração de dados relativamente mais fácil, no entanto, os pesquisadores não podem usar novos tipos de dados de forma eficaz sem uma ferramenta computacional robusta. O scNanoGPS preenche uma lacuna entre as tecnologias e as aplicações. Esperamos tornar a poderosa tecnologia de sequenciamento de célula única de leitura longa disponível e acessível para todos os laboratórios gerais", disse Gao.
Mais informações: Cheng-Kai Shiau et al, Análises de sequenciamento de leitura longa de célula única de alto rendimento de genótipos e fenótipos da mesma célula em tumores humanos, Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39813-7 Informações do diário: Comunicações da Natureza