As enzimas que quebram proteínas desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos. Tais proteases estão geralmente presentes num estado inactivo, tornando-se apenas activadas sob certas condições. Alguns estão ligados a doenças como infecções ou câncer, tornando importante ter métodos que possam detectar seletivamente proteases ativas.



Em artigo publicado na revista Angewandte Chemie International Edition , os cientistas introduziram uma nova classe de sensores de atividade de protease:nanopartículas de ouro equipadas com DNA peptídico.

Liderada por Devleena Samanta e Anna Capasso (Universidade do Texas em Austin, EUA), a equipe mostrou que essas nanossondas podem detectar múltiplas proteases ativas em paralelo (medição multiplexada). O método funciona à temperatura ambiente e não requer preparação complicada de amostras ou instrumentos elaborados.

No centro das novas sondas estão nanopartículas de ouro equipadas com cadeias feitas de um peptídeo e um fragmento de DNA. A estrutura do peptídeo é projetada para ser dividida pela protease que está sendo detectada. O DNA atua como um código de barras exclusivo para identificar o peptídeo e também amplifica o sinal. Se a protease desejada estiver presente na sua forma ativa na amostra, o peptídeo a divide. Isso libera o código de barras do DNA na solução, onde pode ser detectado com base em sua sequência.

Para realizar essa detecção, a equipe utiliza um teste CRISPR/Cas12a:a enzima Cas12a se liga a um RNA guia (gRNA) para formar um complexo inativo. O gRNA contém um segmento que se liga especificamente ao DNA do código de barras. Isso ativa o Cas12a, para que ele possa agora “cortar” o DNA de fita simples (ssDNA).

Para o teste, os pesquisadores adicionam moléculas de ssDNA com um grupo fluorescente (fluoroforo) em uma extremidade e um supressor, que “desliga” a fluorescência do fluoróforo (desde que estejam próximos o suficiente), na outra. Se o ssDNA for cortado, o fluoróforo e o supressor se distanciarão ainda mais. Isto resulta numa forte fluorescência que indica que a protease testada está presente (limite de detecção de cerca de 58 pM).

Se não houver instrumentos disponíveis no local e o teste tiver que ser rápido, a detecção é possível a olho nu:se a protease divide o peptídeo na sonda, a carga superficial das nanopartículas de ouro muda e elas se agregam. A cor dessas chamadas "nanoestruturas plasmônicas" depende significativamente do seu grau de agregação. É possível detectar concentrações nanomolares de protease com base na mudança de cor na solução de teste.

A detecção multiplexada das proteases 3CL e caspase3 permitiu à equipe demonstrar a alta sensibilidade e seletividade de seu novo método. 3CL é um marcador de infecção ativa por coronavírus e os pacientes com COVID muitas vezes também apresentam atividade elevada do marcador de apoptose caspase3. O potencial clínico deste teste também foi demonstrado pela detecção de catepsina B, uma protease relacionada ao câncer colorretal, em três linhas celulares tumorais diferentes obtidas de pacientes.

Essas nanossondas produzem sinais de fluorescência 100 vezes maiores em comparação com sensores de protease comerciais baseados em fluorescência. Além disso, virtualmente qualquer protease pode ser detectada se o péptido que ela divide for conhecido. Juntas, essas nanossondas podem potencialmente permitir a detecção precoce de doenças e melhorar a precisão e a confiabilidade dos testes de diagnóstico por meio da multiplexação.

Mais informações: Subrata Pandit et al, DNA-Barcoded Plasmonic Nanostructures for Activity-Based Protease Sensing, Angewandte Chemie International Edition (2023). DOI:10.1002/anie.202310964
Informações do diário: Angewandte Chemie Edição Internacional

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