A microscopia de força atômica (AFM) oferece um método para imagens sem rótulo de dinâmica biomolecular em nanoescala para resolver questões biológicas que não podem ser abordadas por meio de outros métodos de bioimagem, incluindo fluorescência e microscopia eletrônica de varredura. Como esses métodos de imagem só são possíveis para sistemas biológicos extraídos de células ou reconstruídos em substratos sólidos, a nanodinâmica dentro de células vivas permanece inacessível com os métodos de bioimagem existentes. Em um novo relatório agora publicado em Science Advances , Marcos Penedo e uma equipe de pesquisa em Nanolife Science e biotecnologia da Universidade de Kanazawa, no Japão, superaram os limites da bioimagem usando nanoendoscopia-AFM. Durante o processo, eles inseriram uma sonda em forma de agulha em uma célula viva para apresentar fibra de actina, mapas tridimensionais (3D) e nanodinâmica 2D do andaime interno da membrana com alterações indetectáveis ​​na viabilidade celular. Ao contrário dos métodos AFM anteriores, o nanoprobe acessou diretamente os componentes intracelulares alvo e explorou os recursos do AFM, incluindo imagens de alta resolução, mapeamento nanomecânico e reconhecimento molecular para expandir a gama observável de estruturas intracelulares em células vivas.
Dinâmica intracelular de bioimagem

A dinâmica em escala molecular dos componentes intracelulares fornece informações sobre os mecanismos fundamentais das funções e doenças celulares. No entanto, métodos de imagem diretos para tal nanodinâmica em células vivas são desafiadores. Por exemplo, enquanto a microscopia eletrônica é útil para a imagem de nanoestruturas de células congeladas no vácuo, elas são incapazes de visualizar a nanodinâmica em células vivas em ambientes fisiológicos, exceto como instantâneos estáticos de conformações fixas. Da mesma forma, enquanto a microscopia de fluorescência via rotulagem de fluorescência fornece um método poderoso para visualizar a dinâmica de proteínas e organelas em células vivas, elas são limitadas por uma incapacidade de imagem eficiente em nanoescala. Portanto, existem fortes demandas para um método de imagem intracelular sem rótulo em ambientes líquidos. A microscopia de força atômica (AFM) é um candidato potencial para o papel com a capacidade de imagem na escala subnanométrica para visualizar a nanodinâmica de lipídios, proteínas e DNAs sem rótulos. No entanto, tais imagens não são representativas de sistemas biológicos como resultado de extração de uma célula ou reconstrução em substrato sólido in vitro. Neste trabalho, portanto, Penedo et al. propuseram um método de imagem baseado em AFM conhecido como nanoendoscopia-AFM para observar a nanodinâmica dentro de células vivas sem rotulá-las ou separá-las.

Experiências de nanoendoscopia-AFM

Durante os experimentos, assim como uma câmera endoscópica, os pesquisadores inseriram uma longa nanossonda em forma de agulha dentro de uma célula viva para realizar imagens AFM 2D e 3D. A equipe mostrou como a nanoendoscopia-AFM forneceu uma vantagem única para imagens de células vivas intracelulares sem rótulo em nanoescala. O método fornece um caminho poderoso para observar fenômenos até então inexplorados em sistemas biológicos. Penedo et ai. introduziu repetidamente o nanoprobe dentro da célula em diferentes posições da área desejada por meio de medições de curva de força versus distância. Para obter imagens de toda a célula, a nanossonda tinha que ser longa o suficiente para penetrar completamente na célula até atingir o substrato e com diâmetros abaixo de 200 nm para minimizar os danos celulares, facilitando a penetração na membrana. A equipe usou uma ponta tetraédrica de silício comercial como uma nanossonda, que eles moeram usando moagem de feixe de íons focado nas dimensões preferidas. A equipe usou em seguida as nanosondas dentro de diferentes áreas de uma célula HeLa. Eles adquiriram uma imagem 3D de nanoendoscopia-AFM de uma célula inteira durante os experimentos e identificaram o núcleo da célula HeLa do resto da célula. Outras medições também indicaram as estruturas granulares internas. Para minimizar o dano celular durante a penetração, Penedo et al. reduziu a força de penetração e o comprimento de indentação tanto quanto possível. Eles também realizaram experimentos de viabilidade celular para confirmar que a nanoendoscopia 3D-AFM não levou a danos celulares graves ao usar nanossondas com diâmetros abaixo de 200 nm. Usando 3D nanoendoscopy-AFM, eles facilitaram a imagem do citoesqueleto interno em células vivas para observar a organização 3D das fibras não suportadas. A equipe também combinou com sucesso imagens intracelulares resultantes de nanoendoscopia 3D-AFM e microscopia confocal.

Nanoendoscopia-AFM 2D

A capacidade de inserir uma nanossonda longa em uma célula muitas vezes, mantendo a viabilidade celular, implicou o potencial de localizar o ápice da sonda dentro de uma célula viva para realizar medições locais de AFM 2D/3D sem danos substanciais. A nanossonda pode ser inserida dentro da célula para medir o lado citoplasmático da membrana celular através do modo de modulação de amplitude AFM. As nanossondas tinham que ser longas o suficiente para penetrar completamente na célula e chegar ao fundo, sendo finas o suficiente para reduzir o dano celular. Para conseguir isso na prática, Penedo et al. desenvolveram nanossondas feitas de carbono amorfo usando deposição de feixe de elétrons e mediram a dependência da amplitude com a distância, para determinar a integridade da célula. Eles realizaram experimentos de nanoendoscopia-AFM 2D usando uma célula de fibroblastos para ilustrar a estrutura reticular da membrana celular interna e observaram a arquitetura celular para estudar a dinâmica interna das estruturas celulares. O trabalho destacou a possibilidade de usar a nanoendoscopia 2D-AFM para estudar a nanodinâmica de estruturas internas em células vivas em ambientes fisiológicos.

Perspectivas

Desta forma, Marcos Penedo e colegas mostraram as aplicações da nanoendoscopia-AFM para medir superfícies citoplasmáticas internas de membranas celulares e scaffolds associados para entender o arranjo 3D de filamentos de actina em seu ambiente intracelular natural em células vivas. A equipe procurou minimizar os danos às células usando nanossondas ultrafinas em forma de agulha nos experimentos. Os métodos AFM propostos produziram mapas 3D de estruturas celulares internas, além de projeções 2D combinadas com métodos de fluorescência existentes, como microscopia confocal ou super-resolução. O método lançará luz sobre a maquinaria celular em ação, in vivo, enquanto expõe motores moleculares fisiológicos. O método também abrirá novas possibilidades para estudar a nanomecânica intracelular que desempenha um papel importante nas funções celulares. A equipe pode usar o método para medir as características de rigidez, adesão e dissipação do núcleo para extrair informações biológicas adequadas para campos interdisciplinares de biologia celular e medicina. + Explorar mais

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