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  • Proteínas projetadas montam anticorpos em nanocages modulares
    p Proteínas projetadas montam anticorpos em grandes arquiteturas simétricas. Proteínas de agrupamento de anticorpos projetadas (cinza claro) montam anticorpos (roxo) em diversas arquiteturas de nanocage (topo). Os nanocages de anticorpos aumentam a sinalização celular em comparação com os anticorpos livres (parte inferior). Crédito:Ciência, doi:10.1126 / science.abd9994

    p Em um novo relatório agora publicado em Ciência , Robby Divine e uma equipe de pesquisa interdisciplinar do departamento de bioquímica, Medicina regenerativa, e vacinas e doenças infecciosas na University of Washington U.S. and the School of Medicine, na Universidade de Ciências Médicas de Teerã, Irã, conduziu projetos computacionais de nanocages para montar anticorpos em arquiteturas precisas. Durante a construção, um componente estrutural formou um anticorpo ou fusão Fc-ligante e o segundo projeto formou um homo-oligômero de ligação de anticorpo para conduzir a montagem de nanocage com diferentes valências e simetria. A equipe levantou a hipótese de como esse processo também pode aumentar a neutralização de um pseudovírus; síndrome respiratória aguda grave coronavírus-2 (SARS-COV-2) via anticorpos monoclonais α-SARS-COV-2 e proteínas de fusão Fc-enzima conversora de angiotensina 2 (ACE-2). p Anticorpos em pesquisas médicas

    p Os anticorpos que se ligam especificamente a alvos de interesse desempenham um papel central na pesquisa biomédica e na medicina. Os pesquisadores podem gerar grupos de anticorpos ligando geneticamente fragmentos de anticorpos para melhorar a sinalização. Atualmente é difícil formar conjuntos de anticorpos com uma variedade de arquiteturas e valências precisas. Nesse trabalho, Divine et al. proteínas projetadas computacionalmente que montam anticorpos em arquiteturas precisas com diferentes valências e simetrias. A equipe formulou a hipótese de que tais projetos poderiam conduzir robustamente anticorpos arbitrários em nanocages homogêneos e estruturalmente bem definidos para efeitos pronunciados na sinalização celular. Os pesquisadores projetaram proteínas para conduzir a montagem de anticorpos arbitrários em montagens simétricas com estruturas bem definidas. Por esta, eles fundiram rigidamente três tipos de unidades de "blocos de construção" contendo domínios de ligação a Fc de anticorpos, conectores de repetição helicoidal e módulos de formação de oligômero cíclico. Em sua arquitetura, a unidade de ligação a Fc posicionou-se com o dímero de anticorpo C2, o homo-oligômero cíclico formou o segundo eixo de simetria cíclica no nanocage, e o conector de repetição helicoidal ligou o anticorpo e os eixos de simetria do homo-oligômero cíclico na orientação correta para formar os nanocages de anticorpo denominados AbCs.

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    p Projeto de nanocage de anticorpo (AbC). (A) A geometria poliédrica é especificada. No sentido horário a partir do canto superior esquerdo:icosaédrica, diédrico, octaédrico, e geometrias tetraédricas são mostradas. (B) Um modelo de anticorpo Fc de hIgG1 está alinhado a um dos eixos C2 (neste caso, um diedro D2 é mostrado). (C) Ligantes de Fc de anticorpos são fundidos a conectores de repetição helicoidal que são então fundidos à subunidade monomérica de oligômeros cíclicos helicoidais. Todas as combinações de blocos de construção e junções de blocos de construção são amostradas (inserção inferior sombreada em cinza; os números entre parênteses referem-se ao número de blocos de construção disponíveis). (D) As fusões tripartidas são verificadas para garantir o alinhamento bem-sucedido dos eixos de simetria C2 Fc com os da arquitetura poliédrica (no caso da simetria D2 mostrada aqui, os eixos C2 devem se cruzar em um ângulo de 90 °). (E) As fusões que passam os critérios geométricos avançam com o redesenho da cadeia lateral, Onde, por exemplo, os aminoácidos são otimizados para garantir que os resíduos do empacotamento do núcleo sejam apolares e compactos e que os resíduos expostos ao solvente sejam polares. (F) Os oligômeros formadores de AbC projetados são expressos bacterianamente, purificado, e montado com anticorpo Fc ou IgG. Crédito:Ciência, doi:10.1126 / science.abd9994

    Os experimentos

    p Para formar projetos de gaiola de anticorpo (AbC), Divine et al. moléculas de ligação de domínio constante de anticorpo rigidamente fundidas a oligômeros cíclicos usando domínios espaçadores helicoidais. Eles facilitaram o processo por meio de domínios espaçadores helicoidais de modo que os eixos de simetria do anticorpo dimérico e do oligômero cíclico pudessem estar em orientações que gerassem diversas arquiteturas diédricas ou poliédricas. Os cientistas otimizaram as regiões de junção entre os blocos de construção conectados para se dobrarem nas estruturas projetadas. A abordagem de fusão baseou-se em grandes conjuntos de blocos de construção com muitos locais de fusão possíveis por bloco de construção como critérios geométricos rigorosos para formar a arquitetura simétrica desejada. A equipe usou um método computacional para o design da gaiola do anticorpo para gerar o diedro, tetraédrico, AbCs octaédricos e icosaédricos e usaram uma convenção de nomenclatura para descrever as arquiteturas finais de nanocage. Divine et al. a seguir expressaram genes sintéticos que codificam os designs em culturas bacterianas de Escherichia coli. Por exemplo, os projetos de sucesso incluíram o decaédrico D-2 (três projetos), Arquiteturas T-32 (um projeto) e 152 icosaédricas (dois projetos) contendo dois, seis, 12 ou 30 anticorpos, respectivamente. Eles caracterizaram os AbCs Fc usando espalhamento de raios-X de baixo ângulo e microscopia eletrônica. Os nanocages reconstruídos estavam em estreita concordância com os modelos de design computacional. Para avaliar a estabilidade de nanocages, Divine et al. usaram leituras de espalhamento de luz dinâmico para obter estabilidade encorajadora para permitir a caracterização de seu impacto biológico a seguir.

    p Caracterização estrutural de AbCs. (A) Modelos de design, com anticorpo Fc (roxo) e oligômeros formadores de AbC projetados (cinza). (B) Sobreposição de traços representativos de SEC de montagem formados pela mistura de design e Fc (preto) com os dos componentes únicos em cinza (design) ou roxo (Fc). (C) imagens EM com médias de classe 2D sem referência na inserção; todos os dados são do NS-EM, com exceção dos designs o42.1 e i52.3 (cryo-EM). (D e E) Micrografias representativas de SEC (D) e NS-EM com médias de classe 2D sem referência (E) das mesmas gaiolas de anticorpo projetadas montadas com IgG1 humano completo (com as 2 regiões Fab intactas). Em todos os casos EM mostrados em (C) e (E), conjuntos foram primeiro purificados via SEC, e as frações correspondentes ao pico mais à esquerda foram agrupadas e usadas para geração de imagens para remover qualquer desenho em excesso ou componente Ig. Barras de escala, 200 nm. Crédito:Ciência, doi:10.1126 / science.abd9994

    p Efeitos na sinalização celular

    p Os AbCs projetados forneceram uma plataforma geral para entender o efeito da valência e geometria do envolvimento do receptor na ativação da via de sinalização. A ampla gama de anticorpos de ligação ao receptor e ligantes naturais formados com o método AbC desenvolvido neste trabalho permitiu a sondagem pronta e sistemática do efeito da geometria e valência da associação da subunidade do receptor na sinalização celular para quase todas as vias. Para explorar a praticidade desta abordagem, Divine et al. anticorpos montados ou fusões Fc-ligante visando uma variedade de vias de sinalização em gaiolas de anticorpos (AbCs) e estudou seu impacto na sinalização. Por exemplo, os AbCs, formado com uma apoptose induzida por anticorpo direcionado ao receptor de morte (morte celular) de linhas de células tumorais que até então não haviam sido afetadas pelo anticorpo solúvel ou pelo ligante nativo. Além disso, a montagem de fusões Fc ou anticorpos em AbCs, permitiu a sinalização aprimorada da via da angiopoietina, Sinalização de CD-40 e proliferação de células T. A formação de AbC permitiu ainda a neutralização de um pseudovírus in vitro, como coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2.

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    p Reconstruções 3D de AbCs formados com Fc. Os modelos de design computacional (representação em desenho animado) de cada AbC são ajustados na densidade 3D determinada experimentalmente a partir de EM. Cada nanocage é visualizado ao longo de um eixo de simetria desocupado (esquerda) e girado para olhar para baixo um dos eixos C2 de simetria ocupados pelo Fc (direita). As reconstruções tridimensionais de o42.1 e i52.3 são de análise crio-EM, todos os outros são da NS-EM. Crédito:Ciência, doi:10.1126 / science.abd9994

    Panorama

    p O método detalhado neste trabalho, foi além dos esforços de design computacional anteriores para criar nanomateriais de proteína que integram forma e função. Os AbCs, portanto, usaram anticorpos como componentes estruturais e funcionais para alcançar uma ampla gama de geometrias e orientações. Esta estratégia é aplicável para projetar vacinas com nanocages montados com glicoproteínas virais usando componentes que terminam em domínios de ligação de glicoproteína para maximizar a proximidade dos locais ativos. Desta maneira, Robby Divine e colegas projetaram várias proteínas formadoras de gaiolas de anticorpos para agrupar com precisão qualquer anticorpo de ligação de proteína em nanocages por meio de valência e geometria controladas. A equipe usou dois, seis e 12 ou 30 anticorpos dentro dos AbCs simplesmente misturando o anticorpo com a proteína projetada correspondente sem modificações covalentes adicionais. Os cientistas adicionaram anticorpos de ligação a receptores ou neutralizantes de vírus em ABCs para aumentar sua atividade biológica em sistemas celulares variados. A equipe espera que este resultado para a montagem rápida de anticorpos dentro de nanocages ordenados sem modificações covalentes tenha amplas aplicações em pesquisa e medicina.

    p AbCs ativam as vias de sinalização de apoptose e angiogênese. (A e B) Caspase-3/7 é ativada por AbCs formados com anticorpo a-DR5 (A), mas não o anticorpo livre, em células cancerosas renais RCC4 (B). (C e D) AbCs a-DR5 (C), mas não os controles Fc AbC (D), reduzir a viabilidade celular 4 dias após o tratamento. (E) AbCs de a-DR5 reduzem a viabilidade 6 dias após o tratamento. (F e G) AbCs o42.1 a-DR5 aumentam a clivagem de PARP, um marcador de sinalização apoptótica; (G) é uma quantificação de (F) em relação ao controle de PBS. (H) O domínio F da angiopoietina-1 foi fundido a Fc (A1F-Fc) e montado em AbCs octaédricos (o42.1) e icosaédricos (i52.3). (I) Western blots representativos mostram que A1F-Fc AbCs, mas não controles, aumenta os sinais pAKT e pERK1 / 2. (J) Quantificação de (I):a quantificação de pAKT é normalizada para sinalização o42.1 A1F-Fc (sem sinal de pAKT no controle de PBS); pERK1 / 2 é normalizado para PBS. (K) A1F-Fc AbCs aumentam a estabilidade vascular após 72 horas. (Left) Quantification of vascular stability compared with PBS. (Right) Representative images; scale bars, 100 mm. All error bars represent means ± SEM; means were compared using analysis of variance and Dunnett post-hoc tests (tables S8 and S9). *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001 Credit:Science, doi:10.1126/science.abd9994

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