p Uma abordagem inovadora para calibrar microscópios de alta tecnologia permite aos pesquisadores rastrear o movimento de moléculas individuais em 3D em nanoescala. p Uma equipe de pesquisa da Universidade de Stanford, liderado por W. E. Moerner, estende o trabalho que rendeu a Moerner e seus colegas Eric Betzig e Stefan W. Hell o Prêmio Nobel de Química de 2014. Betzig e Moerner foram os pioneiros no desenvolvimento de imagens de super-resolução, que quebrou o limite de difração da microscopia óptica, usando a fluorescência de moléculas individuais pela primeira vez. O novo trabalho, publicado na revista de alto impacto da The Optical Society Optica , demonstra uma melhoria marcante na precisão desta técnica de imagem e para moléculas de rastreamento em três dimensões.

p Rastreando como as moléculas se movem, formar formas e interagir com as células e neurônios do corpo oferece uma nova visão poderosa dos principais processos biológicos, como sinalização, divisão celular e comunicação neuronal, todos os quais afetam a saúde das pessoas e a suscetibilidade a doenças.

p Capitalizando em uma transformação em microscopia

p A microscopia de super-resolução usa lasers para excitar a fluorescência de moléculas únicas sob condições em que apenas algumas estão emitindo por vez, superando o limite de resolução tradicional para microscopia óptica definido pelo limite de difração da luz.

p "Com o advento da imagem de super-resolução, melhoramos a resolução por um fator de 5 a 10 além do limite de difração - de 200 nanômetros até 40 ou até 10 nanômetros, "Moerner disse." Este novo mundo de resolução muito aumentada traz uma grande transformação na forma como o sistema óptico funciona. "

p Contudo, técnicas de calibração anteriores para microscopia de super-resolução não eram suficientemente precisas para medições 3D de moléculas individuais. O novo método de calibração usa um arranjo de nanohole para corrigir distorções ópticas em todo o campo de visão de um microscópio de campo amplo.

p Lidando com Distorção

p Ao fazer imagens na escala de moléculas individuais, um único ponto de luz proveniente de uma molécula pode normalmente ser localizado com uma precisão de cerca de 10 nanômetros. Em resoluções tão altas, qualquer pequena imperfeição em um sistema óptico introduz distorções de imagem, ou aberrações, o que pode distorcer significativamente as medições, particularmente em 3D. Os erros resultantes podem significar a diferença entre interpretar duas moléculas como interagindo ou simplesmente estando próximas uma da outra.

p Enquanto muitos usam esferas fluorescentes para calibrar microscópios 3D, Alex von Diezmann, candidato a doutorado no Laboratório Moerner, Universidade de Stanford, adotou uma abordagem diferente. Ele criou uma série de orifícios em um filme de metal, cada um menor que 200 nanômetros e regularmente espaçados de 2,5 mícrons, para usar como um padrão de calibração 3D. Uma vez que os buracos foram preenchidos com corantes fluorescentes, a matriz pode ser usada para calibrar erros ópticos em todo o campo de visão do microscópio, não apenas em alguns pontos selecionados, como é possível usando esferas fluorescentes. Usando esta técnica, os pesquisadores foram capazes de corrigir aberrações de 50-100 nanômetros a apenas 25 nanômetros.

p "Antes desta, as pessoas não se preocuparam explicitamente com essas aberrações, "von Diezmann disse." O fato de termos demonstrado a presença de aberrações dependentes de campo, e mostrou que eles podem degradar imagens, é uma parte importante deste trabalho. "

p Os pesquisadores estudaram a nova técnica de calibração com funções de dupla hélice e espalhamento de ponto astigmático, dois tipos de modificação óptica normalmente usados ​​para extrair a localização do eixo z. Embora ambas as funções de propagação de pontos mostrassem imprecisões relacionadas ao eixo z que criaram cerca de 20 por cento de erro nas medições 3D, os pesquisadores corrigiram essas aberrações usando a matriz de nanohole 3D.

p Demonstrando benefícios para o estudo de proteínas em bactérias

p Os pesquisadores agora estão aplicando a nova técnica de calibração 3D a todos os seus estudos de microscopia de super-resolução e rastreamento de molécula única. Por exemplo, Von Diezmann o está usando para estudar a localização de proteínas em bactérias que medem apenas dois mícrons de comprimento. Com a técnica de calibração 3D, ele pode medir e rastrear com precisão proteínas-chave de sinalização em nanodomínios que têm apenas 150 a 200 nanômetros de tamanho.

p Os pesquisadores apontam que a correção de aberrações dependentes de campo e outros tipos está se tornando cada vez mais importante à medida que as técnicas de microscopia óptica evoluem para imagens mais profundas nas células, por exemplo.

p "Estudamos essa abordagem em alguns casos, mas pode ser usado com qualquer super-resolução ou microscopia de localização que requeira medições 3D realmente precisas, "disse von Diezmann." Será emocionante ver outros grupos usá-lo para descobrir como sua técnica particular é afetada por aberrações dependentes de campo. Como uma comunidade, talvez possamos encontrar maneiras ainda melhores de lidar com essas aberrações. "

p Os pesquisadores produziram uma ferramenta de calibração 3D criando uma série de buracos em nanoescala preenchidos com corante fluorescente. Em um), a iluminação de campo amplo (verde) passa pela lamela de vidro em um nanohole gravado em uma camada de alumínio. A solução de corante fluorescente preenche os buracos, e os pontos de luz resultantes (laranja) são detectados por baixo. A Figura (b) mostra uma imagem de microscópio eletrônico de varredura dos orifícios, que têm 200 nanômetros ou menos de diâmetro.