Quando os cientistas precisaram visualizar a estrutura da proteína do pico, que coronavírus usam para se infiltrar em células humanas, eles se voltaram para a microscopia crioeletrônica. Uma das ferramentas de imagem mais poderosas no arsenal de um pesquisador, microscopia crioeletrônica (crio-EM) pode visualizar proteínas, patógenos e diversos componentes celulares quase até seus átomos individuais.

Mas preparar amostras para crio-EM é um processo complicado que depende de etano - um poderoso refrigerante na forma líquida, e um gás inflamável em temperatura ambiente sujeito a explosões.

Um novo estudo publicado em 7 de setembro no Jornal da União Internacional de Cristalografia demonstra que as amostras crio-EM podem ser preparadas com um refrigerante mais seguro e menos caro - nitrogênio líquido - e essas amostras podem produzir imagens ainda mais nítidas do que aquelas preparadas com etano. As descobertas derrubam a sabedoria convencional que remonta à década de 1980, e pode melhorar a segurança e a qualidade do crio-EM.

"O etano não é um produto químico padrão de laboratório. É perigoso, e usá-lo adiciona complicações adicionais, "disse o autor sênior Robert Thorne, professor de física na Faculdade de Artes e Ciências e bolsista presidencial Weiss. "O nitrogênio líquido é o refrigerante de escolha."

O Cryo-EM atua disparando elétrons através de moléculas que são congeladas em uma lâmina de água vítrea, captura de várias imagens difusas das moléculas dentro do gelo. Softwares sofisticados costumam fazer a média desses clipes desfocados em uma imagem 3D nítida, mas não de forma consistente.

Algumas manchas vêm da própria amostra. Quando a água que envolve as moléculas é resfriada muito lentamente, forma cristais de gelo que degradam a imagem. Os cientistas contornam esse problema usando etano para resfriar a água tão rapidamente que ela se transforma em um vidro, folha sem cristal. Mas esse congelamento rápido coloca estresse na folha, que repousa sobre uma fina película de ouro. Quando o feixe de elétrons atinge a folha, o estresse faz com que as moléculas se movam, borrar a imagem final em um fenômeno conhecido como movimento induzido por feixe.

"Temos dois fatores opostos, - disse Thorne. - Queremos resfriar as amostras rápido, para prevenir a formação de cristais de gelo e para capturar a estrutura biológica das moléculas. Mas também queremos resfriar as amostras o mais lentamente possível para minimizar seu movimento durante a geração de imagens. "

O etano resfria as amostras muito rapidamente. Mas os pesquisadores devem usar nitrogênio líquido para converter o gás etano em líquido, e mais nitrogênio líquido para armazenar as amostras depois de congeladas. "Etano é complicado, é perigoso, e, em última análise, as amostras acabam em nitrogênio líquido de qualquer maneira, - disse Thorne.

O nitrogênio líquido esfria a taxas cerca de 50 vezes mais lentas do que as do etano, de acordo com relatórios dos últimos 40 anos, e isso não é rápido o suficiente para converter a água em uma lâmina vítrea. Mas em 2006, O grupo de pesquisa de Thorne descobriu que o principal fator para desacelerar o nitrogênio era o gás frio pairando sobre a superfície do líquido, que resfriou pequenas amostras antes mesmo de chegarem ao líquido.

A empresa de Thorne, MiTeGen, acabou desenvolvendo um instrumento de resfriamento automatizado para cristalografia de raios-X - outro método usado para imagens de moléculas de proteína - que remove o gás frio pouco antes de uma amostra ser mergulhada no nitrogênio, e descobriram que as taxas de resfriamento aumentaram para apenas seis vezes mais lentas do que o etano. A equipe da MiTeGen adaptou seu instrumento de resfriamento para amostras crio-EM e colaborou com a equipe do Cornell Center for Materials Research e o associado de pós-doutorado Jonathan Clinger para coletar e analisar dados crio-EM.

Conforme relata o novo estudo, o nitrogênio esfria na velocidade perfeita para a preparação da amostra crio-EM - rápido o suficiente para evitar a formação significativa de cristais de gelo, mas lento o suficiente para reduzir o movimento induzido pelo feixe posteriormente.

"Etano é um exagero, - disse Thorne. - Para velocidade você não precisa, você está obtendo imagens borradas com movimento induzido por feixe, e isso é mais problemático do que quaisquer cristais de gelo que se formam a partir de um resfriamento ligeiramente mais lento. "

E resfriamento de nitrogênio totalmente líquido, Thorne disse, simplificará os fluxos de trabalho crio-EM, removendo as etapas extras exigidas pelo etano e tornando mais fácil projetar instrumentos de resfriamento automatizados que atendam aos padrões atuais de segurança de laboratório.

"Esta é uma bela ilustração de como a ciência acadêmica básica - ver como os objetos pequenos são frios e como o gelo se forma dentro deles - pode levar a soluções práticas e produtos comerciais."